pcr擴(kuò)增的原理

實(shí)驗(yàn)方法原理

①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至94℃左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)做準(zhǔn)備；

②模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；

③引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在Taq酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留copy原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)1制鏈。

重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過(guò)程，就可獲得更多的“半保留復(fù)1制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需2～4分鐘， 2～3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍。

典型的PCR包括高溫變性、低溫退火、中溫延伸三個(gè)步驟，通過(guò)將這一套過(guò)程不斷循環(huán)，使DNA得以成百萬(wàn)倍的擴(kuò)增。

PCR出現(xiàn)假陰性

不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶。PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有①模板核酸的制備，②引物的質(zhì)量與特異性，③酶的質(zhì)量及Br乙錠的使用， ④PCR循環(huán)條件。尋找原因亦應(yīng)針對(duì)上述環(huán)節(jié)進(jìn)行分析研究。

模板：①模板中含有雜蛋白質(zhì)，②模板中含有Taq酶抑制1劑，③模板中蛋白質(zhì)沒(méi)有消化除凈，特別是染色體中的組蛋白，④在提取制備模板時(shí)丟失過(guò)多，或吸入酚。⑤模板核酸變性不徹底。在酶和引物質(zhì)量好時(shí)，不出現(xiàn)擴(kuò)增帶，極有可能是標(biāo)本的消化處理，模板核酸提取過(guò)程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應(yīng) 固定不宜隨意更改。

PCR法不僅僅局限于分子生物學(xué)，還因其簡(jiǎn)便、迅速等特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、法醫(yī)學(xué)、食品、環(huán)境衛(wèi)生檢驗(yàn)、動(dòng)植物檢驗(yàn)等其它領(lǐng)域。Taq DNA聚合酶是PCR法普遍使用的聚合酶，但其具有如下局限性。

1. 可信度 (Fidelity)：通常Taq DNA Polymerase的Fidelity并不高，PCR反應(yīng)有時(shí)會(huì)出現(xiàn)錯(cuò)配 (Misincorporation) 現(xiàn)象，因而PCR克1隆、變異導(dǎo)入等實(shí)驗(yàn)中，需加以注意。

2. 擴(kuò)增的DNA長(zhǎng)度：使用Taq DNA Polymerase進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，通?？蓴U(kuò)增幾kb的DNA，超過(guò)10 kb則比較困難。這就給利用PCR進(jìn)行Mapping等Genome解析帶來(lái)麻煩。

3. 擴(kuò)增量：使用Taq DNA Polymerase進(jìn)行PCR產(chǎn)物克1隆及食品、環(huán)境衛(wèi)生檢驗(yàn)等時(shí)，擴(kuò)增量常常達(dá)不到要求。為解決以上難題，Takara在對(duì)Polymerase、Buffer及反應(yīng)條件等進(jìn)行深入研究的基礎(chǔ)上，開(kāi)發(fā)了LA PCR (Long and Accurate PCR) 技術(shù)，運(yùn)用此技術(shù)可大量正確地?cái)U(kuò)增長(zhǎng)達(dá)40 kb 的DNA部分片段。LA PCR技術(shù)擴(kuò)展了PCR的應(yīng)用范圍，可在Genome解析、基因診斷、長(zhǎng)片段 DNA的克1隆及變異導(dǎo)入等方面發(fā)揮優(yōu)勢(shì)。