1.人ELISA試劑盒在測定時，受檢標(biāo)本（測定其中的antibody或抗原）與固相載體表面的抗原或antibody起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原antibody復(fù)合物與液體中的其他物質(zhì)分開?！　?

2.再加入酶標(biāo)記的抗原或antibody，也通過反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上。此時固相上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。　　

3.加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進行定性或定量分析。　　

4.由于酶的催化效率很高，間接地放大了免1疫反應(yīng)的結(jié)果，使測定方法達到很高的敏感度。ELISA可用于測定抗原，也可用于測定antibody?！　?

5.然而，影響Elisa試驗結(jié)果的因素很多，故加強各個環(huán)節(jié)的質(zhì)量保證才能充分發(fā)揮其方法學(xué)的優(yōu)點。

傳統(tǒng)小分子特異性antibody制備技術(shù)

為解決小分子這類半抗原物質(zhì)無法刺激宿主動物產(chǎn)生antibody的特性，必須將半抗原回復(fù)完全抗原的特性。解決這個問題可以通過將小分子和對宿主動物immune原性很強的物質(zhì)：如OVA、BSA、KLH等偶聯(lián)，將其制備成完全抗原，通過immune宿主動物，便能促使宿主動物產(chǎn)生針對小分子的特異性antibody，這類antibody通過抗原特異性的篩選便能獲取目的antibody。目前，通過此項技術(shù)能解決絕大多數(shù)小分子特異性antibody的制備，但是也可能由于小分子的結(jié)構(gòu)特異，偶聯(lián)物和偶聯(lián)方式的選取、偶聯(lián)率的差異以及immune技術(shù)有待發(fā)展等多方面的因素使其特異性antibody的制備存在困難。

PCR方法已廣泛用于科研，在工業(yè)中也有不斷擴大應(yīng)用的趨勢，它包括檢測一些病原體、檢測支原體污染、檢測細(xì)菌污染以及檢測殘留宿主DNA等。

PCR在工業(yè)中的應(yīng)用主要存在一個方法驗證的問題，尤其是靈敏度的驗證。靈敏度不夠，就會發(fā)生漏檢。另外，PCR所直接面對的樣本是DNA，而非病原菌或DNA，因此還需要做DNA抽提，這也是要注意的。

因此，如能采用PCR檢測支原體并替代藥典方法，還是能節(jié)省很多時間和精力。但PCR方法的驗證需要較為完整。靈敏度驗證是一個重要方面。靈敏度不夠，就會發(fā)生漏檢?！稓W洲藥典》第2.6.7章（EP 2.6.7）和《日本藥典》第十七版第G3章（JP G3），都規(guī)定，對于核酸擴增法（如PCR）檢測支原體，如替代傳統(tǒng)的培養(yǎng)法，都要求檢測限達到10 CFU/ml。

具體驗證可使用10CFU的支原體靈敏度標(biāo)準(zhǔn)品，它一般為凍干粉形式，需要用待測樣本的樣本基質(zhì)（需保證里面不含支原體）來復(fù)溶，再進行DNA抽提以及PCR檢測。如檢測的電泳有條帶，或者qPCR檢測后的Ct值小于40，即表明檢測成功。

在選用支原體PCR法檢測來替代藥典方法時，需要考慮如下兩個方面：

首先一步是要使用符合歐洲藥典要求，經(jīng)過全方面驗證的支原體檢測試劑盒，第二部是自我驗證，即確認(rèn)所用的樣本基質(zhì)對于該試劑盒方法是合適的，并且操作過程是正確的。小規(guī)模的室內(nèi)驗證通常需要采用三個不同批次的試劑盒，然后加入10CFU的標(biāo)準(zhǔn)品，做復(fù)孔（通常是8個復(fù)孔），并且至少選擇3個支原體物種進行驗證。

有的支原體標(biāo)準(zhǔn)品廠家會提供CFU與基因拷貝數(shù)的比值，以方便二者的換算。因為10CFU只能確定PCR能夠達到的檢測限在10CFU以下，但無法具體確定靈敏度的數(shù)值。帶DNA拷貝數(shù)標(biāo)定的基因組DNA標(biāo)準(zhǔn)品則可進一步確定檢測限的數(shù)值。

總之，PCR方法很有用，但需要避免假陰性，驗證時應(yīng)使用陽性對照、陰性對照、無模板對照和內(nèi)控對照，以保證PCR反應(yīng)正常，以及支原體少量存在時確實能檢出來，支原體不存在時也確保是結(jié)果陰性，從而使得PCR方法在工業(yè)應(yīng)用時能確保zui終結(jié)果的可靠。