污染的監(jiān)測

一個好的實驗室，要時刻注意污染的監(jiān)測，考慮有無污染是什么原因造成的污染，以便采取措施，防止和消除污染。

1、陽性對照：在建立PCR反應(yīng)實驗室及一般的檢驗單位都應(yīng)設(shè)有PCR陽性對照，它是PCR反應(yīng)是否成功、產(chǎn)物條帶位置及大小是否合乎理論要求的一個重要的參考標志。陽性對照要選擇擴增度中等、重復(fù)性好，經(jīng)各種鑒定是該產(chǎn)物的標本，如以重組質(zhì)粒為陽性對照，其含量宜低不宜高（100個拷貝以下）。但陽性對照尤其是重組質(zhì)粒及高濃度陽性標本，其對檢測或擴增樣品污染的可能性很大。因而當某一PCR試劑經(jīng)自己使用穩(wěn)定，檢驗人員心中有數(shù)時，在以后的實驗中可免設(shè)陽性對照。

2、陰性對照：每次PCR實驗務(wù)必做陰性對照。它包括：

  （1）標本對照：被檢的標本是血1清就用鑒定后的正常血1清作對照；被檢的標本是組織細胞就用相應(yīng)的組織細胞作對照。

  （2）試劑對照：在PCR試劑中不加模板DNA或RNA,進行PCR擴增，以監(jiān)測試劑是否污染。

3、重復(fù)性試驗。

4、選擇不同區(qū)域的引物進行PCR擴增。

隨機引物擴增技術(shù)(arbitrary primedPCR, AP- PCR)

AP-PCR技術(shù)通過隨意設(shè)計或選擇一個非特異性引物.在PCR反應(yīng)體系中.首先在不嚴格條件下使引物與模板中許多序列通過錯配而復(fù)性。如果在兩條單鏈上相距一定距離有反向復(fù)性引物存在,則可經(jīng)Taq酶的作用使引物延伸而發(fā)生DNA部分片段的擴增。經(jīng)一至數(shù)輪不嚴格條件下的PCR循環(huán)后，再于嚴格條件下進行擴增。擴增的產(chǎn)物經(jīng)DNA測序凝膠電泳分離后.經(jīng)放1射性自顯影或熒光顯示即可得到DNA指紋圖。AP-PCR用于腫1瘤的抑制基因、癌基因的分離;菌1種、菌株及不同物種的鑒定;遺傳作圖;不同分化程度或某些不同狀態(tài)下的組織的基因表達差異等方面的研究。

差示PCR (differential PCR, d -PCR)技術(shù)

d-PCR可以定量檢測標本靶基因的拷貝數(shù)。它是將目的基因和一個單拷貝的參照基因置于一個試管中進行PCR擴增。電泳分離后呈兩條區(qū)帶,比較兩條區(qū)帶的豐度，或在引物5°-端標記上放1射性核素后.通過檢測兩條區(qū)帶放1射性強度即可測出目的基因的拷貝數(shù)。

定量PCR(quantitative PCR, qPCR)技術(shù)

qPCR技術(shù)是用合成的RNA作為內(nèi)標來檢測PCR擴增目的mRNA的量,涉及目的mRNA和內(nèi)標用相同的引物共同擴增.但擴增出不同大小片段的產(chǎn)物.可容易地電泳分離。一種內(nèi)標可用于定量多種不同目的mRNA。qPCR可用 于研究基因表達。能提供特定DNA基因表達水平的變化.在癌1癥、代謝紊亂及自身免1疫性疾病的診斷和分析中很有價值。

PCR技術(shù)不僅可用于基礎(chǔ)研究，還適用于日常的臨床診斷、法醫(yī)學(xué)調(diào)查和農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究。這些應(yīng)用要求可靠的性能、及時的靈敏度和嚴格的標準。因此，所使用的PCR儀和PCR試劑必須符合這些要求和目的。

分子診斷應(yīng)用包括基因檢測、致癌突變檢測以及感1染性疾病檢測。在法醫(yī)學(xué)中，利用 PCR進行人類身份鑒定是通過對特別的短串聯(lián)重復(fù)序列（STR）進行擴增而區(qū)分個體的。在農(nóng)業(yè)學(xué)中，PCR在食物病原體檢測、育種植物基因分型和 GMO測試中具有重要作用。