差示PCR (differential PCR, d -PCR)技術

d-PCR可以定量檢測標本靶基因的拷貝數。它是將目的基因和一個單拷貝的參照基因置于一個試管中進行PCR擴增。電泳分離后呈兩條區(qū)帶,比較兩條區(qū)帶的豐度，或在引物5°-端標記上放1射性核素后.通過檢測兩條區(qū)帶放1射性強度即可測出目的基因的拷貝數。

定量PCR(quantitative PCR, qPCR)技術

qPCR技術是用合成的RNA作為內標來檢測PCR擴增目的mRNA的量,涉及目的mRNA和內標用相同的引物共同擴增.但擴增出不同大小片段的產物.可容易地電泳分離。一種內標可用于定量多種不同目的mRNA。qPCR可用 于研究基因表達。能提供特定DNA基因表達水平的變化.在癌1癥、代謝紊亂及自身免1疫性疾病的診斷和分析中很有價值。

PCR有哪些應用領域？

基因表達

通常可通過PCR來檢測不同細胞類型、組織和生物體在特定時間點的基因表達差異。首先，從目標樣品中分離出RNA并將mRNA逆轉錄成cDNA。隨后，通過由PCR擴增的cDNA數量，確定mRNA的初始水平。這一過程也被稱為逆轉錄PCR。

終點PCR 可通過凝膠里的擴增產物條帶強度對RNA的表達進行定量（一種半定量方法）。例如，對起始cDNA進行連續(xù)稀釋并擴增。通過凝膠電泳使不同起始量的終點PCR得率可視化，然后對條帶強度進行定量，并以管家基因為參照進行標準化，預估擴增靶點的相對表達水平。如今，終點PCR已基本被實時PCR 或qPCR 取代了，因為它們可獲得和的基因表達定量結果。

 PCR反應五要素

參加PCR反應的物質主要有五種即引物(PCR引物為DNA部分片段,細胞內DNA復1制的引物為一段RNA鏈)、酶、dNTP、模板和緩沖液(其中需要Mg2 )。

[PCR步驟]標準的PCR過程分為三步:

1.DNA變性(90°C-96*C): 雙鏈DNA模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈DNA

2.退火(25C-65'C): 系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結合，形成局部雙鏈。

3.延伸(70°C-75*C): 在Taq酶(在72C左右，活性zui佳)的作用下，以dNTP為原料，從引物的5'端→3'端延伸，合成與模板互補的DNA鏈。

每一循環(huán)經過變性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍。現在有些PCR因為擴增區(qū)很短，即使Taq酶活性不是zui佳也能在很短的時間內copy完成，因此可以改為兩步法，即退火和延伸同時在60°C -65C間進行，以減少一次升降溫過程，提

高了反應速度。

污染原因：

1、標本間交叉污染：標本污染主要有收集標本的容器被污染，或標本放置時，由于密封不嚴溢于容器外，或容器外粘有標本而造成相互間交叉污染；標本核酸模板在提取過程中，由于吸樣污染導致標本間污染；有些微生物標本尤其是病毒可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴散，導致彼此間的污染。

2、PCR試劑的污染：主要是由于在PCR試劑配制過程中，由于加樣、容器、雙蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染。

3、PCR擴增產物污染：這是PCR反應中主要常見的污染問題。因為PCR產物拷貝量大（一般為1013拷貝/ml），遠遠高于PCR檢測數個拷貝的極限，所以極微量的PCR產物污染，就可形成假陽性。還有一種容易忽視，可能造成PCR產物污染的形式是氣溶膠污染。在空氣與液體面摩擦時就可形成氣溶膠，在操作時比較劇烈地搖動反應管，開蓋時、吸樣時及污染進樣的反復吸樣都可形成氣溶膠而污染。據計算一個氣溶膠顆?？珊?8000拷貝，因而由其造成的污染是一個值得特別重視的問題。

4、實驗室中質粒的污染：在分子生物學實驗室及某些用質粒做陽性對照的檢驗室，這個問題也比較常見。因為質粒在單位容積內含量相當高，另外在純化過程中需用較多的用具及試劑，而且在內的質粒，由于的生長繁殖的簡便性及具有很強的生命力。其污染可能性也很大。