PCR產(chǎn)物的回收（膠回收試劑盒）

1.膠回收的目的（1）去除非特異性擴增的產(chǎn)物（2）去除多余的底物（3）去除多余的Taq酶（4）得到目的片段

2.膠回收的過程（1）切膠：紫外下切膠，稱重。之后用槍頭將膠塊搗碎。切膠的刀片建議選用一次性刀片，實驗臺等也盡可能用乙醇擦拭干凈?？赏ㄟ^空EP管與裝膠EP管質(zhì)量的差值計算膠的質(zhì)量。注意切膠時盡可能避免切到條帶外的凝膠，且避免紫外時間過長。別忘記膠條有厚度，前后多余的部分也盡量切除。（2）溶膠：每1 mg膠加入1 μL膜結(jié)合液（MB），按比例1:1加入MB，55℃水浴溶解。每1~2 min震蕩混勻，待溶解后至少在水浴中保持1~2 min，保證膠塊完全溶解。在電泳過程中，DNA會與大分子的多糖緊密結(jié)合，凝膠的種類和質(zhì)量不同，DNA與之結(jié)合力也不同，只有凝膠充分溶解DNA才能充分釋放。否則，凝膠將與DNA一起沉淀下來，洗脫后將影響回收結(jié)果的純度。（3）結(jié)合：將溶膠轉(zhuǎn)移至純化柱內(nèi)，12000 rpm離心1 min，倒掉收集管中的廢液，將純化柱重新插回收集管中。膠塊完全溶解后建議將膠液溫度降至室溫再上柱，因為純化柱在溫度較高時結(jié)合DNA的能力較弱。

回收產(chǎn)物的檢測

1.紫外分光光度計法檢測DNA在OD260處有明顯吸收峰，當OD260=1時，相當于大約50 ng/μL雙鏈DNA、40 ng/μL單鏈DNA。OD260/OD280≈1.6~1.9時，說明DNA純度較高。若洗脫時不用洗脫緩沖液，而是用去離子水，會使比值偏低，因為離子的存在會影響吸光度。但不表示純度低。

2.SYBR法檢測取回收產(chǎn)物1 μL，與1 μL SYBR染料混勻，于熒光透1視儀下觀察是否有黃綠色熒光。

3.瓊脂糖凝膠電泳法檢測取回收產(chǎn)物5 μL，與10×Loading Buffer混勻，DNA Marker加5 μL，電泳后凝膠成像觀察。5 μL DNA Marker相當于每個條帶50 ng DNA，觀察目的條帶亮度大致為Marker的兩倍，則大致估算其濃度約為20 ng/μL。

提取DNA常用的方法

　　一.酚抽提法：先用蛋酶K、SDS破碎細胞，消化蛋白，然后用酚和酚-氯DNA大小為100-150kb

　　二.甲酰胺解聚法：破碎細胞同上，然后用高濃度甲酰胺解聚蛋白質(zhì)與DNA的結(jié)合，再透析獲得DNA可得DNA200kb左右。

　　三.玻璃棒纏繞法：用鹽酸胍裂解細胞，將裂解物鋪于乙醇上，然后用帶鉤或U型玻璃棒在界面輕攪，DNA沉淀液繞于玻棒。生成DNA約80kb。

　　四.異丙1醇沉淀法：基本同1法，僅用二倍容積異丙1醇替代乙醇，可去除小分子RNA(在異丙1醇中可溶狀態(tài))

　　五.表面活性劑快速制備法：用Triton X-100A或NP40表面活性劑破碎細胞，然后用蛋白酶K或酚去除蛋白，乙醇沉淀或透析。

　　六.加熱法快速制備：加熱96℃-100℃，五分鐘，然后離心后取上清，可用于PCR反應。

　　七.堿變性快速制備：先用NaOH作用20分鐘，再加HCI中和，離心后取上清，含少量DNA。