蛋白質(zhì)測定試劑

（1）標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：用標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)晶牛血1清清蛋白（bsa）或標(biāo)準(zhǔn)酪蛋白，配制成10mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，可用bsa濃度1mg/ml的a280為0.66來校正其純度。如有需要，標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)還可預(yù)先用微量凱氏定氮法測定蛋白氮含量，計算出其純度，再根據(jù)其純度，稱量配制成標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液。牛血1清清蛋白用H2O 或0.9%NaCl配制，酪蛋白用0．05NaOH配制。

（2）雙縮脲試劑：稱以1.50克硫酸銅（CuSO4?5H2O）和6.0克酒石酸鉀鈉（KNaC4H4O6?4H2O），用500毫升水溶解，在攪拌下加入300毫升10% NaOH溶液，用水稀釋到1升，貯存于塑料瓶中（或內(nèi)壁涂以石蠟的瓶中）。此試劑可長期保存。若貯存瓶中有黑色沉淀出現(xiàn)，則需要重新配制。

folin―酚試劑法早先是由lowry確定了蛋白質(zhì)濃度測定的基本步驟。以后在生物化學(xué)領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。這個測定法的優(yōu)點是靈敏度高，比雙縮脲法靈敏得多，缺點是費(fèi)時間較長，要準(zhǔn)確控制操作時間，標(biāo)準(zhǔn)曲線也不是嚴(yán)格的直線形式，且專一性較差，干擾物質(zhì)較多。對雙縮脲反應(yīng)發(fā)生干擾的離子，同樣容易干擾lowry反應(yīng)。而且對后者的影響還要大得多。酚類、檸檬酸、硫酸銨、tris緩沖液、甘氨酸、糖類、甘油等均有干擾作用。濃度較低的尿素（0.5%），硫酸納（1%），NaNO濃度（1%），TCA（0.5%），乙醇（5%），C4H10O（5%），CH3COCH3（0.5%）等溶液對顯色無影響，但這些物質(zhì)濃度高時，必須作校正曲線。含硫酸銨的溶液，只須加濃碳酸鈉―NaOH溶液，即可顯色測定。若樣品酸度較高，顯色后會色淺，則必須提高碳酸鈉―NaOH溶液的濃度1～2倍。



20世紀(jì)70年代以來，人們通過酶組織染色法，利用胰蛋白酶對肥大細(xì)胞(MC)進(jìn)行染色，發(fā)現(xiàn)MC能夠被染色，說明MC中一定含有胰蛋白酶活性物質(zhì)。1981年Schwartz等進(jìn)一步純化這種酶后發(fā)現(xiàn)，它是由MC釋放的，其活性90%以上來自一種酶，故命名為類胰蛋白酶。Miller等在1989年克1隆了第yi種類胰蛋白酶cDNA，其后又有幾種類胰蛋白酶被克1隆。類胰蛋白酶在cDNA和蛋白水平被分為三類：α、β、γ，其中β含量zui高。每個類胰蛋白酶基因均含有6個外顯子和5個內(nèi)含子，編碼30個氨基酸的前導(dǎo)鏈和245個氨基酸的活性的部位。通過氨基酸序列推斷，α-類胰蛋白酶和β-類胰蛋白酶有90%的同源性。其主要區(qū)別在于β-類胰蛋白酶的-3位和215位氨基酸分別為精氨酸和甘氨酸，而α-類胰蛋白酶則分別為谷氨酰胺和天冬氨酸，兩者的結(jié)構(gòu)區(qū)別決定了它們活性差異。