PCR的創(chuàng)建

Khorana (1971)等zui早提出核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想：“經(jīng)DNA變性，與合適的引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復(fù)該過程便可合成tRNA基因。”但由于當(dāng)時(shí)基因序列分析方法尚未成熟，熱穩(wěn)定DNA聚合酶尚未報(bào)道以及引物合成的困難，這種想法似乎沒有實(shí)際意義。加上分子克1隆技術(shù)的出現(xiàn)提供了一種克1隆和擴(kuò)增基因的途徑，所以Khorana的設(shè)想被人們遺忘了。

1983年4月的一個(gè)星期五晚上，他開車去鄉(xiāng)下別墅的路上,猛然閃現(xiàn)出“多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)”的想法。

1983年12月，Mullis用同位素標(biāo)記法看到了10個(gè)循環(huán)后的49 bp長度的第yi個(gè)PCR片段；

1985年，Kary Mullis在Cetus公司工作期間，發(fā)明了PCR。Mullis要合成DNA引物來進(jìn)行測序工作，卻常為沒有足夠多的模板DNA而煩惱。

1985年10月25日申請了PCR的專1利，

1987年7月28日批準(zhǔn)（專1利號4,683,202 ），Mullis是第yi個(gè)發(fā)明人；

1985年12月20日在Science雜志上發(fā)表了第yi篇PCR的學(xué)術(shù)論1文，Mullis是共同作者；

1986年5月，Mullis在冷泉港實(shí)驗(yàn)室做專題報(bào)告，全世界從此開始學(xué)習(xí)PCR的方法。

不對稱PCR(asymmetric PCR）枝術(shù)

兩種引物濃度比例相差較大的PCR技術(shù)稱不對稱PCR.在擴(kuò)增循環(huán)中引入不同的引物濃度.常用50~ 100 1比例。在起初的10~ 15個(gè)循環(huán)中主要產(chǎn)物還是雙鏈DNA.但當(dāng)?shù)蜐舛纫锉幌谋M后。高濃度引物介導(dǎo)的PCR反應(yīng)就會(huì)產(chǎn)生大量單鏈DNA.

應(yīng)用:可制備單鏈DNA部分片段用于序列分析或核酸雜交的探針。

反轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription, RT- PCR技術(shù)

當(dāng)擴(kuò)增模板為RNA時(shí)。需先通過反轉(zhuǎn)錄酶將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA才能進(jìn)行擴(kuò)增。RT - PCR應(yīng)用非常廣泛。無論是分子生物學(xué)還是臨床檢驗(yàn)等都經(jīng)常采用。

修飾引物PCR技術(shù)

為達(dá)到某些特殊應(yīng)用目的.如定向克1隆、定1點(diǎn)突變、體外轉(zhuǎn)錄及序列分析等?？稍谝锏?*-端加上酶切位點(diǎn)、突變序列、轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子及序列分析結(jié)合位點(diǎn)等。

污染原因：

1、標(biāo)本間交叉污染：標(biāo)本污染主要有收集標(biāo)本的容器被污染，或標(biāo)本放置時(shí)，由于密封不嚴(yán)溢于容器外，或容器外粘有標(biāo)本而造成相互間交叉污染；標(biāo)本核酸模板在提取過程中，由于吸樣槍污染導(dǎo)致標(biāo)本間污染；有些微生物標(biāo)本尤其是病毒可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴(kuò)散，導(dǎo)致彼此間的污染。

2、PCR試劑的污染：主要是由于在PCR試劑配制過程中，由于加樣槍、容器、雙蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染。

3、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物污染：這是PCR反應(yīng)中主要常見的污染問題。因?yàn)镻CR產(chǎn)物拷貝量大（一般為1013拷貝/ml），遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于PCR檢測數(shù)個(gè)拷貝的極限，所以極微量的PCR產(chǎn)物污染，就可形成假陽性。還有一種容易忽視，可能造成PCR產(chǎn)物污染的形式是氣溶膠污染。在空氣與液體面摩擦?xí)r就可形成氣溶膠，在操作時(shí)比較劇烈地?fù)u動(dòng)反應(yīng)管，開蓋時(shí)、吸樣時(shí)及污染進(jìn)樣槍的反復(fù)吸樣都可形成氣溶膠而污染。據(jù)計(jì)算一個(gè)氣溶膠顆?？珊?8000拷貝，因而由其造成的污染是一個(gè)值得特別重視的問題。

4、實(shí)驗(yàn)室中質(zhì)粒的污染：在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室及某些用質(zhì)粒做陽性對照的檢驗(yàn)室，這個(gè)問題也比較常見。因?yàn)橘|(zhì)粒在單位容積內(nèi)含量相當(dāng)高，另外在純化過程中需用較多的用具及試劑，而且在內(nèi)的質(zhì)粒，由于的生長繁殖的簡便性及具有很強(qiáng)的生命力。其污染可能性也很大。