PCR有哪些應(yīng)用領(lǐng)域？

基因表達(dá)

通?？赏ㄟ^PCR來檢測不同細(xì)胞類型、組織和生物體在特定時(shí)間點(diǎn)的基因表達(dá)差異。首先，從目標(biāo)樣品中分離出RNA并將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。隨后，通過由PCR擴(kuò)增的cDNA數(shù)量，確定mRNA的初始水平。這一過程也被稱為逆轉(zhuǎn)錄PCR。

終點(diǎn)PCR 可通過凝膠里的擴(kuò)增產(chǎn)物條帶強(qiáng)度對RNA的表達(dá)進(jìn)行定量（一種半定量方法）。例如，對起始cDNA進(jìn)行連續(xù)稀釋并擴(kuò)增。通過凝膠電泳使不同起始量的終點(diǎn)PCR得率可視化，然后對條帶強(qiáng)度進(jìn)行定量，并以管家基因?yàn)閰⒄者M(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，預(yù)估擴(kuò)增靶點(diǎn)的相對表達(dá)水平。如今，終點(diǎn)PCR已基本被實(shí)時(shí)PCR 或qPCR 取代了，因?yàn)樗鼈兛色@得和的基因表達(dá)定量結(jié)果。

基因分型

PCR可用于檢測特定細(xì)胞或生物體中等位基因的序列差異。例如，基因敲除和敲入小鼠等生物的基因分型[3]。引物對經(jīng)設(shè)計(jì)位于目標(biāo)區(qū)域側(cè)翼，可根據(jù)是否存在擴(kuò)增子及擴(kuò)增子長度來檢測遺傳變異。

但是如果為了檢測特定核苷酸突變，則必須對擴(kuò)增的序列進(jìn)行進(jìn)一步分析。例如， PCR擴(kuò)增子測序就是研究單核苷酸變異（SNVs）和單核苷酸多態(tài)性（SNP）的方法之一。強(qiáng)烈推薦使用高保真DNA聚合酶，以防止在PCR過程中引入多余的突變。

通過PCR進(jìn)行基因分型也是對癌1癥和遺傳病中的 突變進(jìn)行遺傳分析的一個(gè)基本方式。

突變：PCR克1隆的一大優(yōu)點(diǎn)是能夠通過克1隆將所需突變引入目的基因中，以便進(jìn)行突變研究。在 定1點(diǎn)突變中，經(jīng)過設(shè)計(jì)的PCR引物可將堿基置換、刪除或插入整合到特定序列中。引物定位到已克1隆至質(zhì)粒中的序列上。隨后，含有引入突變的PCR產(chǎn)物通過自我連接，重新生成環(huán)狀質(zhì)粒，并用于轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞。

測序：PCR是為測序富集模板DNA的一種相對簡單的方法。為保證DNA序列準(zhǔn)確性，強(qiáng)烈建議使用高保真PCR來制備測序模板。在 Sanger測序中，PCR擴(kuò)增片段經(jīng)純化并用于測序反應(yīng)。使用常用的測序引物結(jié)合位點(diǎn)對PCR引物的 5′末端進(jìn)行標(biāo)記，以簡化測序工作流程。

         二代測序 （NGS）中，PCR被廣泛用于構(gòu)建DNA測序文庫。在NGS文庫制備中，DNA樣品通過PCR反應(yīng)富集（在起始量有限的情況下）并使用adaptor（以及用于多重檢測的index）標(biāo)記。除了具有高保真度，DNA聚合酶還應(yīng)具有zui小的擴(kuò)增偏好性，從而使測序文庫具有高覆蓋度。

原位PCR儀

它是由主機(jī)，加熱模塊，玻片，熱蓋，控制軟件組成。主要是應(yīng)用對細(xì)胞或組織內(nèi)的DNA部分片段進(jìn)行原位擴(kuò)增分析-即定位分析，如病源基因在細(xì)胞的位置或目的基因在細(xì)胞內(nèi)的作用位置等。是保持細(xì)胞或組織的完整性，使PCR反應(yīng)體系滲透到組織和細(xì)胞中，在細(xì)胞的靶DNA所在的位置上進(jìn)行基因擴(kuò)增，不但可以檢測到靶DNA，又能標(biāo)出靶序列在細(xì)胞內(nèi)的位置，于分子和細(xì)胞水平上研究疾病的發(fā)病機(jī)理和臨床過程及病理的轉(zhuǎn)變有重大的實(shí)用價(jià)值。它無需將細(xì)胞破碎提取DNA，細(xì)胞內(nèi)有DNA酶的作用擴(kuò)增受到一定的影響，使用不是很普遍。

該儀器主要應(yīng)用于醫(yī)學(xué)臨床研究，如癌細(xì)胞等。