DNA連接酶不需要模板，因?yàn)镈NA連接酶是將DNA雙鏈上的兩個(gè)缺口同時(shí)連接起來(lái)。用DNA連接酶連接具互補(bǔ)粘性末端的DNA1片段或是用T4DNA連接酶直接將平末端的DNA1片段連接起來(lái)。

DNA聚合酶是以一條DNA鏈為模板，將單個(gè)核苷酸通過(guò)磷酸二酯鍵形成一條與模板鏈互補(bǔ)的DNA鏈。DNA聚合酶的結(jié)構(gòu)是三磷酸腺苷。

堿性磷酸酶（ALP或AKP）是廣泛分布于人體肝1臟、骨骼、腸、shen和胎1盤(pán)等組織經(jīng)肝1臟向膽外排出的一種酶。這種酶能催化核酸分子脫掉5’磷酸基團(tuán)，從而使DNA或RNA部分片段的5’-P末端轉(zhuǎn)換成5’-OH末端。但它不是單一的酶，而是一組同功酶。目前已發(fā)現(xiàn)有AKP1、AKP2、AKP3、AKP4、AKP5與AKP6六種同功酶。其中第yi、2、6種均來(lái)自肝1臟，第3種來(lái)自骨細(xì)胞，第4種產(chǎn)生于胎1盤(pán)及癌細(xì)胞，而第5種則來(lái)自小1腸絨毛上皮與成纖維細(xì)胞。



長(zhǎng)基因組序列、特別是包含大的基因簇的那些的克1隆對(duì)于產(chǎn)生medicine和生物燃料的合成生物學(xué)和基因工程工作特別重要。傳統(tǒng)的基于PCR的克1隆方法通常受限于DNA模板的長(zhǎng)度和GC含量：標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)常規(guī)產(chǎn)生至多10 kb的片段，而更長(zhǎng)的PCR產(chǎn)物需要反應(yīng)條件的繁瑣優(yōu)化，并且甚至在理想條件下，通常受限于35 kb5?；蛘?，可通過(guò)裝配多個(gè)短片段，例如重疊PCR產(chǎn)物或化學(xué)合成的DNA寡聚物，產(chǎn)生長(zhǎng)的目的基因組序列，但這樣的方法趨于耗時(shí)和昂貴，特別是對(duì)于獲得長(zhǎng)于50 kb的序列(其通常需要3-5階段，每個(gè)包含多個(gè)裝配事件)6,7。獲得長(zhǎng)的基因組序列的另一方法是通過(guò)基因組DNA的限制性酶消化。



當(dāng)DNA聚合酶 III沿著滯后鏈模板移動(dòng)時(shí)，由特異的引發(fā)酶催化合成的RNA引物即可以由DNA聚合酶 III所延伸，合成DNA。當(dāng)合成的DNA鏈到達(dá)前一次合成的岡崎片段的位置時(shí)，滯后鏈模板及剛合成的岡崎片段從DNA聚合酶 III上釋放出來(lái)。由于copy叉繼續(xù)向前運(yùn)動(dòng)，便又產(chǎn)生了一段單鏈的滯后鏈模板，它重新環(huán)繞DNA聚合酶 III,通過(guò)DNA聚合酶III開(kāi)始合成新的滯后鏈岡崎片段。通過(guò)這種機(jī)制，前導(dǎo)鏈的合成不會(huì)超過(guò)滯后鏈太多，這樣引發(fā)體在DNA鏈上和DNA聚合酶 III以同一速度移動(dòng)。在copy叉附近，形成了以DNA聚合酶 III二聚體、引發(fā)體和解旋酶構(gòu)成的類(lèi)似核糖體大小的以物理方式結(jié)合成的復(fù)合體，稱(chēng)為DNA copy體。copy體在DNA前導(dǎo)鏈模板和滯后鏈模板上移動(dòng)時(shí)便合成了連續(xù)的DNA前導(dǎo)鏈，以及由許多岡崎片段組成的滯后鏈。當(dāng)岡崎片段形成后，DNA聚合酶I通過(guò)其 5'→3'外切酶活性切除岡崎片段上的RNA引物，并利用后一個(gè)岡崎片段作為引物由 5'→3'合成DNA填補(bǔ)缺口。zui后由DNA連接酶將岡崎片段連接起來(lái)，形成完整的DNA滯后鏈。