低溫生物菌種的注意事項(xiàng)

無論采用何種保藏方法，首先應(yīng)該挑選典型菌種的優(yōu)良純種來進(jìn)行保藏，保藏它們的休眠體，如分生孢子、芽孢等。其次，應(yīng)根據(jù)微生物生理、生化特點(diǎn)，人為地創(chuàng)造環(huán)境條件，使微生物長期處于代謝不活潑、生長繁殖受抑制的休眠狀態(tài)。這些人工造成的環(huán)境主要是干燥、低溫和缺氧，另外，避光、缺乏營養(yǎng)、添加保護(hù)劑或酸度中和劑也能有效提高保藏效果。

生物有機(jī)肥產(chǎn)品生產(chǎn)菌種安全性分析

雖然目前生物有機(jī)肥產(chǎn)品生產(chǎn)菌種大多采用植物根際促生菌， 但近年來很多研究發(fā)現(xiàn)，芽孢菌屬和類芽孢菌個(gè)別菌株能產(chǎn)生菌素。 即便在菌種安全分級(jí)目錄中列為一級(jí)免做理學(xué)試驗(yàn)的菌種， 如枯草芽孢菌、 多類芽孢菌、 地衣芽孢菌等個(gè)別菌株也檢測到部分溶血素基因， 潛在危害不容忽視。 因此， 開展生物有機(jī)肥產(chǎn)品生產(chǎn)菌種生物安全風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)， 從源頭上把好菌種安全關(guān)是產(chǎn)品質(zhì)量安全的首要保障。通過調(diào)研發(fā)現(xiàn)， 用于生物有機(jī)肥產(chǎn)品的部分生產(chǎn)菌種分類地位不明確， 甚至混亂， 難以從源頭上進(jìn)行安全風(fēng)險(xiǎn)的初步識(shí)別 。 以常見生產(chǎn)菌種枯草芽孢菌為例， 實(shí)際上是一個(gè)表型相似的群體， 包括枯草芽孢菌、 地衣芽孢菌、 短小芽孢菌、解淀粉芽孢菌、 深褐 （萎縮） 芽孢菌、莫哈韋（莫杰夫） 芽孢菌、 死谷芽孢菌、 索諾拉沙漠芽孢菌、 特基拉芽孢菌、暹羅芽孢菌等 10個(gè)緣種。生產(chǎn)企業(yè)送檢的枯草芽孢菌生物有機(jī)肥產(chǎn)品， 經(jīng)鑒定發(fā)現(xiàn)很多產(chǎn)品實(shí)際為解淀粉芽孢菌， 且許多菌株具有很強(qiáng)的溶血作用。通過對生產(chǎn)企業(yè)調(diào)研發(fā)現(xiàn)， 部分生產(chǎn)企業(yè)選擇分離于動(dòng)物腸道的解淀粉芽孢菌作為產(chǎn)品生產(chǎn)用菌株， 該類菌種生產(chǎn)發(fā)酵周期短、 活菌數(shù)量高、 生產(chǎn)成本低， 但產(chǎn)品的應(yīng)用功效不佳， 溶血風(fēng)險(xiǎn)大 ， 建議慎用。而植物來源的解淀粉芽孢菌溶血風(fēng)險(xiǎn)小， 產(chǎn)品應(yīng)用效果好， 推薦使用。

低溫生物菌種的液氮冷凍保藏法

(1)準(zhǔn)備安瓿管用于液氮保藏的安瓿管，要求能耐受溫度突然變化而不致破碎，因此，需要采用硼硅酸鹽玻璃制造的安瓿管，安瓿管的大小通常使用75×10mm的，或能容1.2mm液體的。

(2)加保護(hù)劑與滅菌保存細(xì)菌、酵母菌或霉菌孢子等容易分散的細(xì)胞時(shí)，則將空安瓿管塞上棉塞，1.05kg/cm2，121.3℃滅菌15分鐘:若作保存霉菌菌絲體用則需在安瓿管內(nèi)預(yù)先加入保護(hù)劑如10%的甘油蒸餾水溶液或10%二甲亞砜蒸餾水溶液，加入量以能浸沒以后加入的菌落圓塊為限，而后再用1.05kg/cm2>，121.3℃滅菌15分鐘。

(3)接入菌種將菌種用10%的甘油蒸餾水溶液制成菌懸液，裝入已滅菌的安瓿管;霉菌菌絲體則可用滅菌打孔器，從平板內(nèi)切取菌落圓塊，放入含有保護(hù)劑的安瓿管內(nèi)，然后用火焰熔封。浸入水中檢查有無漏洞。

(4)凍結(jié)再將已封口的安瓿管以每分鐘下降1℃的慢速凍結(jié)至-30℃。若細(xì)胞急劇冷凍，則在細(xì)胞內(nèi)會(huì)形成冰的結(jié)晶，因而降低存活率。

(5)保藏經(jīng)凍結(jié)至-30℃的安瓿管立即放入液氮冷凍保藏器(圖Ⅶ-14)的小圓筒內(nèi)，然后再將小圓筒放入液氮保藏器內(nèi)。液氮保藏器內(nèi)的氣相為-150℃，液態(tài)氮內(nèi)為-196℃。

(6)恢復(fù)培養(yǎng)保藏的菌種需要用時(shí)，將安瓿管取出，立即放入38-40℃的水浴中進(jìn)行急劇解凍，直到全部融化為止。再打開安瓿管，將內(nèi)容物移入適宜的培養(yǎng)基上培養(yǎng)。

此法除適宜于一般微生物的保藏外，對一些用冷凍干燥法都難以保存的微生物如支原體、衣原體、氫細(xì)菌、難以形成孢子的霉菌、噬菌體及動(dòng)物細(xì)胞均可長期保藏，而且性狀不變異。缺點(diǎn)是需要特殊設(shè)備。

申請時(shí)，有新的低溫生物菌種的必須要辦理菌種保藏嗎？

如果得到了審批權(quán)人卻沒有構(gòu)成的新菌種要件，顯而易見是需要保藏菌種的。發(fā)酵飼料原料與配方:配制好的發(fā)酵飼料1000公斤，水350-400公斤(夏天350，冬天400)，菌種飼料發(fā)酵劑5公斤,100-200克納豆菌。 制作稀釋活化發(fā)酵液:將菌種5公斤飼料發(fā)酵劑和100-200克納豆菌倒入350-400公斤水中攪拌均勻制成活化發(fā)酵液。 將制成的活化發(fā)酵液與1000公斤發(fā)酵飼料混合均勻，濕度以手捏成團(tuán)不滴水，一觸即散為宜。有攪拌機(jī)的大型養(yǎng)殖場將活化發(fā)酵液慢慢加入飼料中攪拌均勻即可;沒有攪拌機(jī)的養(yǎng)殖戶將活化發(fā)酵液慢慢少量噴到飼料上，用鐵鍬攪拌均勻，注意:不能有團(tuán)塊、水結(jié)塊，用手將團(tuán)塊、水結(jié)塊搓散攪拌均勻。 大型養(yǎng)殖場可以將配置好的飼料在地面壓實(shí)堆成垛或者裝入水泥池壓實(shí)，用塑料薄膜密封或者使用厚實(shí)的不透氣的塑料碎團(tuán)塊、水結(jié)塊。