ELISA試劑盒的制備方法

包括以下步驟：

1)抗原表位的計算機篩選；

2)抗原的制備；

3)采集；

4)間接ELISA方法的建立；

5)間接ELISA方法的敏感性和特異性驗證；

6)試劑盒的穩(wěn)定性驗證；

7)對屠宰場進行臨床檢測。該方法簡單、快速、靈敏度高、特異性強、穩(wěn)定性合格、重復性好。應用本發(fā)明制得的試劑盒能有效檢出戊型病毒，適用于大批量發(fā)病樣本的檢測，可用于豬戊肝的快速診斷，并預防、控制豬戊病毒的流行和阻斷戊病毒由豬向人傳播。

ELISA試劑盒的操作方法——雙夾心法

1.包被：用0.05MPH9.牰碳酸鹽包被緩沖液將稀釋至蛋白質含量為1～10μg/ml。在每個聚乙烯板的反應孔中加0.1ml，4℃ 過夜。次日，棄去孔內溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鐘。（簡稱洗滌，下同）。

2.　加樣：加一定稀釋的待檢樣品0.1ml于上述已包被之反應孔中，置37℃ 孵育1小時。然后洗滌。（同時做空白孔，陰性對照孔及陽性對照孔）。

3.　加酶標：于各反應孔中，加入新鮮稀釋的酶標（經滴定后的稀釋度）0.1ml。37℃ 孵育0.5～1小時，洗滌。

4.　加底物液顯色：于各反應孔中加入臨時配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃ 10～30分鐘。

5.　終止反應：于各反應孔中加入2M硫酸0.05ml。

6.　結果判定：可于白色背景上，直接用肉眼觀察結果：反應孔內顏色越深，陽性程度越強，陰性反應為無色或極淺，依據所呈顏色的深淺，以“ ”、“-”號表示。也可測OD值：在ELISA檢測儀上，于450nm（若以ABTS顯色，則410nm）處，以空白對照孔調零后測各孔OD值，若大于規(guī)定的陰性對照OD值的2.1倍，即為陽性。

ELISA試劑盒主要實驗原理

·包被：抗原或者能以物理性吸附于固相載體表面，原因是蛋白質和聚乙烯表面間的疏水性部分相互吸附，吸附之后能保持抗原反應等活性；

·標記：抗原或者可通過共價鍵與酶連接成酶結合物，而此種酶結合物仍能保持其活性和酶的催化特點；

·顯色：酶結合物與相應包被在固相載體的抗原或者結合后，也被固定在固相載體上，加入酶的底物之后可出現顯色反應，根據反應的顏色深淺可計算抗原或者的相對含量。