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發(fā)布時間:2020-12-01 07:28  






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QF-PCR技術在國外已有較廣泛的應用,但目前尚未在國內(nèi)產(chǎn)前診斷臨床中普遍開展。為規(guī)范使用QF-PCR技術,由國家衛(wèi)生和計劃生育委i員會召集、中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心主辦的"全國產(chǎn)前篩查與診斷技術管理規(guī)范編制研討會"于2015年11月14日在成都召開,會議就QF-PCR等快速產(chǎn)前診斷技術的臨床應用進展及其在國內(nèi)應用中存在的具體問題進行了深入而廣泛的探討,并形成了QF-PCR技術在產(chǎn)前診斷中的應用專家共識。復檢為陽性的,企業(yè)要在當?shù)厥袌霰O(jiān)管、畜牧獸醫(yī)部門監(jiān)督下,按規(guī)定對同批次生豬產(chǎn)品原料進行無害化處理,對相關場所進行徹i底清洗消毒。

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熒光定量PCR早稱TaqMan PCR,后來也叫Real-Time PCR,是美國PE(Perkin Elmer)公司1995年研制出來的一種新的核酸定量技術。該技術是在常規(guī)PCR基礎上加入熒光標記探針或相應的熒光染料來實現(xiàn)其定量功能的。其原理: 隨著PCR反應的進行,PCR反應產(chǎn)物不斷累計,熒光信號強度也等比例增加。每經(jīng)過一個循環(huán),收集一個熒光強度信號,這樣我們就可以通過熒光強度變化監(jiān)測 產(chǎn)物量的變化,從而得到一條熒光擴增曲線圖。實時熒光定量PCR技術于1996年由美國AppliedBiosystems公司推出,由于該技術不僅實現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍,而且與常規(guī)PCR相比,它具有特異性更強、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點。 


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相對常規(guī)PCR而言,熒光定量PCR的主要優(yōu)點是準確地確定初始模板拷貝數(shù)和寬的動態(tài)范圍內(nèi)和高的靈敏度。熒光定量PCR結果可以用于定性(判斷一段序列的有無),也可以用于定量(確定DNA拷貝數(shù)),即qPCR,而常規(guī)PCR只能做半定量。相對定量分析以實時PCR方式執(zhí)行,在實時PCR分析過程中,PCR基因擴增一直在監(jiān)控中,在PCR進行期間進行數(shù)據(jù)采集,而不是在PCR結束時(終點PCR)才獲取數(shù)據(jù)。另外,熒光定量PCR的結果無需通過瓊脂糖凝膠電泳來評估,大大節(jié)省實驗時間,提高實驗效率。還有,由于PCR反應和檢測都在反應管中進行,樣品污染的幾率大大降低,無需擴增后的實驗操作。

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簡單的講PCR技術早是用于擴增一段特異的PCR片段,用于克i隆、測序等實驗,后來也將其用于樣本中特異的PCR片段有無或相對定量,而熒光定量PCR技術則是為了測定樣本中特異的PCR片段相對或絕i對量,是一種測定特異的PCR片段含量的方式。如測定病i人樣本中病原體的含量、實驗樣本中某一特定的mRNA的含量等。如果其他尚未被評估的原料符合以下標準就更有利于病毒存活:蛋白質(zhì)含量高(特別是天然蛋白質(zhì))、豬源、相對表面積較大質(zhì)量(比)、含有載體的微成分。有人講過普通PCR后,通過電泳也可以進行定量,其實是將PCR產(chǎn)物的定量與PCR樣本中模板定量相混了。


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非洲為何難以控制?非洲病毒基因組全長 170~190 kb,為有囊膜的雙鏈 DNA 病毒,病毒粒子大小為 175~215 nm,呈正二十面體結構,也是唯i一的蟲媒DNA病毒。非洲病毒是一種急性、熱性、高度接觸性傳i染病,引起豬的死i亡率可達100%,并且非洲具有潛伏期,即使感i染病毒,但沒有臨床癥狀,就有可能通過非實驗室檢驗技術關卡流入市場,進而導致下游食品企業(yè)相關問題的出現(xiàn)。③安全無毒,不使用傳統(tǒng)方法中的氯i仿等有毒試劑,對實驗操作人員的傷害減少到最少,完全符合現(xiàn)代環(huán)保理念。

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非洲與傳統(tǒng)相似且綜合癥狀復雜難辨,臨床上類似于急性,表現(xiàn)為高熱、皮膚充血、流i產(chǎn)、水腫和臟器出血。我國因之前不屬于非洲i疫情國家,因此沒有相關的針對性研究,目前采用的是原農(nóng)i業(yè)部檢疫所于1997年與美國梅島動物病研究所共同研究的檢測方法,主要是PCR和ELISA,標準遵循GB/T 18648-2002非洲診斷技術。01℃的定量PCR儀,而該公司新近推出的Rotor-Gene6000更可達到±0。隨著相關檢測技術的發(fā)展,對于非洲的檢測方法也更加完善。PCR技術是目前i簡單、快速的分子學檢測方法,但該方法的敏感性有限,因此以PCR為基礎的更新方法應運而生。


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傳統(tǒng)的PCR定量是應用終點PCR來對樣品中的模板量進行定量,通常用凝膠電泳分離,并用熒光染色來檢測PCR反應的終擴增產(chǎn)物。但在PCR反應中,由于模板、試劑、焦磷酸鹽分子的聚集等因素影響聚合酶反應,終導致PCR反應不再以指數(shù)形式進行而進入“平臺期”,而且一些反應的終產(chǎn)物比另一些要多,因此終點PCR反應方法定量并不準確。而熒光定量PCR可以在反應進行過程中進行累積擴增產(chǎn)物的分析和檢測,即“實時”。此外,終點PCR還容易交叉污染,產(chǎn)生假陽性。

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核酸提取儀原理是,經(jīng)裂解液裂解后,細胞核中會釋放出核酸分子,會被吸附在磁珠表面,而蛋白質(zhì)等物質(zhì)不會被吸附,結合了核酸的磁珠被磁性物質(zhì)固定在管壁上轉移到洗脫管中,經(jīng)過反復洗脫,后我們可以得到純凈的DNA。根據(jù)其使用范圍可以分為兩類,一種是大型核酸提取儀,另一種是小型核酸提取儀;主要是利用磁珠純化核酸及蛋白質(zhì)從而達到提取核酸的目的,在細胞、動植物組織等研究方面,一個樣品用一個探針,有效防止樣品之間的交叉污染。每經(jīng)過一個循環(huán),收集一個熒光強度信號,這樣我們就可以通過熒光強度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化,從而得到一條熒光擴增曲線圖。


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