親和柱——原理介紹

親和柱的功能基于抗原與間可逆的特異性結(jié)合反應(yīng)，使其可從復(fù)雜樣品基質(zhì)中特異性地回收目標(biāo)化合物。上樣后，柱中以共價(jià)鍵形式偶聯(lián)在凝膠上的會(huì)與抗原（即目標(biāo)化合物）特異性結(jié)合，雜質(zhì)不會(huì)被結(jié)合，大部分隨樣品溶液流出小柱。通過淋洗的方式除去小柱內(nèi)剩余雜質(zhì)后，使用其他洗脫液（根據(jù)對(duì)應(yīng)產(chǎn)品說明書選擇）進(jìn)行洗脫即可得到潔凈的目標(biāo)化合物溶液，可直接用于后續(xù)檢測(cè)。

親和柱親和層析的基本原理

親和層析是一種吸附層析，抗原（或）和相應(yīng)的（或抗原）發(fā)生特異性結(jié)合，而這種結(jié)合在一定的條件下又是可逆的。

所以將抗原（或）固相化后，就可以使存在液相中的相應(yīng)（或抗原）選擇性地結(jié)合在固相載體上，借以與液相中的其他蛋白質(zhì)分開，達(dá)到分離提純的目的。此法具有有效、快速、簡便等優(yōu)點(diǎn)。

親和柱——親和層析的原理

通常，在開始親和層析前需要預(yù)先進(jìn)行全細(xì)胞提取物的粗制，例如細(xì)胞裂解液，生長培養(yǎng)基。

首先將固定相裝入帶有流動(dòng)相的色譜柱中，其中含有某類特定的生物大分子（從DNA到蛋白質(zhì)，取決于實(shí)驗(yàn)需求）。等待一段時(shí)間使兩相充分混合，隨后將洗滌緩沖液倒入色譜柱中。洗滌緩沖液通過破壞非目標(biāo)生物分子與固定相的較弱結(jié)合來去除非目標(biāo)生物分子。目標(biāo)生物分子對(duì)固定相具有較高的親和力，因此能夠保持與固定相的結(jié)合，而不會(huì)被洗滌緩沖液沖走。然后將洗脫緩沖液倒入含有剩余目標(biāo)生物分子的色譜柱中。洗脫緩沖液比洗滌緩沖液，能夠從更大程度上減弱靶生物分子與固定相之間的相互作用，從而洗脫靶生物分子。洗脫得到的溶液包含洗脫緩沖液和目標(biāo)分子，稱為洗脫液。

固定相一般是凝膠基質(zhì)，常見的有瓊脂糖。為了防止目標(biāo)分子與配體結(jié)合過程中的空間干擾或重疊，首先將含有烴鏈的抑制連接到瓊脂糖珠（固體支持物）上。這種具有烴鏈的抑制通常被稱為瓊脂糖珠和靶分子之間的間隔基。

親和柱——親和層析介紹

將具有特殊結(jié)構(gòu)的親和分子制成固相吸附劑放置在層析柱中，當(dāng)要被分離的蛋白混合液通過層析柱時(shí)，與吸附劑具有親和能力的蛋白質(zhì)就會(huì)被吸附而滯留在層析柱中。那些沒有親和力的蛋白質(zhì)由于不被吸附，直接流出，從而與被分離的蛋白質(zhì)分開，然后選用適當(dāng)?shù)南疵撘?，改變結(jié)合條件將被結(jié)合的蛋白質(zhì)洗脫下來，這種分離純化蛋白質(zhì)的方法稱為親和層析。利用共價(jià)連接有特異配體的層析介質(zhì)分離蛋白質(zhì)混合物中能特異結(jié)合配體的目的蛋白或其它分子的層析技術(shù)。