動物組織細(xì)胞基因組DNA提取

操作步驟

1. 取新鮮或冰凍動物組織塊0.1g（0.5cm3），盡量剪碎。置于玻璃勻漿器中，加入1ml的細(xì)胞裂解緩沖液勻漿至不見組織塊，轉(zhuǎn)入1.5ml 離心管中，加入蛋白酶K

（500ug/ml）20μl，混勻。在65℃恒溫水浴鍋中水浴30min，也可轉(zhuǎn)入37℃水浴12～24h，間歇振蕩離心管數(shù)次。于臺式離心機(jī)以12000 rpm離心5min，取上清液入另

一離心管中。

2.加2倍體積異，倒轉(zhuǎn)混勻后，可以看見絲狀物，用100ul 吸頭挑出，涼干，用200ul TE 重新溶解。（可進(jìn)行PCR反應(yīng)等，需要進(jìn)一步純化的按下列步驟進(jìn)行）

3.加等量的酚??振蕩混勻，離心12000 rpm，5min。

4.取上層溶液至另一管，加入等體積的?，振蕩混勻，離心12000 rpm，5min。

5. 取上層溶液至另一管，加入1/2體積的7.5mol/L氨加入2倍體積的無水乙醇，混勻后室溫沉淀2min ，離心12000 rpm ,10min。

6.小心倒掉上清液，將離心管倒置于吸水紙上，將附于管壁的殘余液滴除掉。

7.用1ml 70%乙醇洗滌沉淀物1次，離心12000 rpm ， 5min。

8.小心倒掉上清液，將離心管倒置于吸水紙上，將附于管壁的殘余液滴除掉，室溫干燥。

9.加200ul TE重新溶解沉淀物，然后置于4℃或?C20℃保存?zhèn)溆谩?

10.吸取適量樣品于GeneQuant上檢測濃度和純度。

蛋白質(zhì)雙向電泳實驗流程

1.三氯yi酸-bing酮沉淀法提取蛋白

2.雙向電泳分離待測樣品

(1)一相等電聚焦前處理按照所用儀器的廠商提供操作手冊進(jìn)行。蛋白質(zhì)上樣濃度不要超過10mg/mL,否則會造成蛋白質(zhì)的聚集或沉淀。

(2)等電聚焦完畢后(約需24hr），若不立即進(jìn)行第二相電泳，膠條可夾在兩層塑料薄膜中于-70℃保存數(shù)月。

(3)等電聚焦好的膠條按廠商提供的操作手冊平衡兩次。平衡完畢后，于電泳儀上用12.5%SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電泳分離。儀器設(shè)置為2.5W/膠 45min，15W/膠 5-8hr，20℃。

3.銀染法對凝膠進(jìn)行染色

(1)固定(2)清洗(3)增敏(4)清洗(5)染色(6)清洗(7)顯影(8)定影(9)水洗

3.凝膠掃描及圖像分析

(1)圖像掃描：凝膠染色后采用Image scanner以300dpi，16-bit模式（65536灰階）進(jìn)行掃描。

(2)圖像分析：掃描完畢后，凝膠繼續(xù)置于1%yi酸中于4℃保存。掃描后的圖像用ImageMaster 2D Platinum software軟件進(jìn)行分析。分析按照軟件廠商提供的說明書進(jìn)行。以zui小點(diǎn)面積30，平滑度2為主要參數(shù)zui大限度檢測蛋白質(zhì)點(diǎn)。以目標(biāo)蛋白質(zhì)3個重復(fù)具有相同趨勢，目標(biāo)蛋白質(zhì)相鄰位點(diǎn)的相對一致性，至少2個重復(fù)有2倍以上差異作為判定差異表達(dá)蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)。免yi共沉淀（Co-IP檢測）是以抗ti和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的方法。

染色質(zhì)免l疫共沉淀技術(shù)(ChIP)

基于體內(nèi)分析而發(fā)展的染色質(zhì)免l疫沉淀分析Chr omat in immunoprecipitat ionassay kit, ChIP)技術(shù)可以真實、完整地反映結(jié)合在DNA序列上的調(diào)控蛋白。由于ChIP采用甲醛固定活l細(xì)胞或者組織的方法，因此能比較真實的反映細(xì)胞內(nèi)TF與Promoter的結(jié)合情況，還可以用來研究組蛋白的各種共價修飾與基因表達(dá)的關(guān)系。近年來,這種技術(shù)得到不斷的發(fā)展和完善。采用結(jié)合微陣列技術(shù)在染色體基因表達(dá)調(diào)控區(qū)域檢查染色體活性,是深入分析癌l癥、心血l管病以及中央神經(jīng)系統(tǒng)紊亂等疾病主要通路的一-種非常有效的工具。標(biāo)準(zhǔn)的生物信息學(xué)分析能夠得到mRNA、lncRNA、circRNA、miRNA各自的研究內(nèi)容，靶向調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、ceRNA網(wǎng)絡(luò)、共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析可以將這幾種RNA聯(lián)合起來分析，從而發(fā)現(xiàn)新的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)模型。

染色質(zhì)免l疫沉淀分析(ChIP) 的基本原理是在活l細(xì)胞狀態(tài)下，當(dāng)用甲醛處理時，相互靠近的蛋白與蛋白、蛋白與核酸(DNA或RNA)之間會產(chǎn)生共價鍵。細(xì)胞內(nèi)，當(dāng)F與Promoter相互結(jié)合時，它們必然靠的比較近或者契合在一起，這個時候用甲醛處理，能使它們之間產(chǎn)生共價鍵。固定的蛋白質(zhì)DNA復(fù)合物通過超聲或酶處理將其隨機(jī)切斷為-定長度范圍內(nèi)的染色質(zhì)小片段然后通過抗原抗l體的特異性識別反應(yīng)沉淀此復(fù)合體，特異性地富集目的蛋白結(jié)合的DNAl片段，通過對目的片斷的純化與檢測，從而獲得蛋白質(zhì)與DNA相互作用的信息。通過qPCR或二代測序，篩選與目的蛋白互作的未知DNA信息。不同個體之間在一個同源STR位點(diǎn)的重復(fù)次數(shù)也不同，因而同指紋識別一樣，STR位點(diǎn)分析也可對個體進(jìn)行身份識別。