原位雜交是指將特定標(biāo)記的已知順序核酸為探針與細(xì)胞或組織切片中核酸進(jìn)行雜交，從而對(duì)特定核酸順序進(jìn)行精3確定量定位的過(guò)程。原位雜交可以在細(xì)胞標(biāo)本或組織標(biāo)本上進(jìn)行。

原位雜交技術(shù)(In situ hybridization，ISH)是分子生物學(xué)、組織化學(xué)及細(xì)胞學(xué)相結(jié)合而產(chǎn)生的一門新興技術(shù)，始于20世紀(jì)60年代。

原位PCR；原位雜交細(xì)胞定位和PCR的高靈敏度相結(jié)合的技術(shù)，在細(xì)胞（爬片、甩片或涂片）或組織（石蠟、冰凍切片）上直接對(duì)靶基因片段進(jìn)行擴(kuò)增，通過(guò)摻入標(biāo)記基團(tuán)直接顯色或結(jié)合原位雜交進(jìn)行檢測(cè)的方法。

就DNA探針和RNA探針的比較，DNA探針在雜交過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)探針雙鏈之間退火的可能，也更傾向于在溶液中形成大分子的探針聚合體，從而影響其滲透能力。而RNA 探針的應(yīng)用，將提高DNA-RNA雜交子的熱穩(wěn)定性。

Tips：RNA探針因其單鏈、高分子結(jié)合力、可適應(yīng)高溫雜交的特性，其檢測(cè)特異性和靈敏度均優(yōu)于DNA探針。常用的RNA探針標(biāo)記方法為構(gòu)建質(zhì)粒后進(jìn)行轉(zhuǎn)率合成。通過(guò)PCR擴(kuò)增的方法，可以更方便地進(jìn)行RNA探針的制備；RNA探針合成后，還需驗(yàn)證其對(duì)目標(biāo)片段檢測(cè)的靈敏度和特異性。

雜交液中的陽(yáng)離子濃度通過(guò)靜電排斥作用影響了雜交體之間的鏈穩(wěn)定性，較高的鹽濃度將增加雜交體的穩(wěn)定性。大于0.4M的Na離子濃度，對(duì)Tm值、雙鏈復(fù)性速率的影響不大，但隨著Na離子濃度的降低，將顯著影響Tm值和雙鏈復(fù)性速率。

有2機(jī)溶2劑（甲酰胺）的作用是降低DNA-DNA和DNA-RNA等雙鏈體的解鏈溫度。通常DNA需要在0.1~0.2M Na 90~100℃的條件下變性，那么應(yīng)用于原位雜交，樣品必須在65~75℃的條件下進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間變性，這將導(dǎo)致樣品形態(tài)學(xué)的破壞。50%甲酰胺的應(yīng)用能將雜交溫度降至30~45℃。

硫酸葡聚糖具有很強(qiáng)的水合性，高濃度的硫酸葡聚糖會(huì)使得核酸分子無(wú)法獲得周邊親水環(huán)境，增加了探針濃度，加快雜交反應(yīng)速率。

總的來(lái)說(shuō)，隨探針濃度增加，雜交率也增加。另外，在較窄的范圍內(nèi)，隨探針濃度增加，敏感性增加。依我們的經(jīng)驗(yàn)，要獲得較滿意的敏感性，膜雜交中32P標(biāo)記探針與非放0射性標(biāo)記探針的用量分別為5～10 ng/ml和25～1000ng/ml，而原位雜交中，無(wú)論應(yīng)用何種標(biāo)記探針，其用量均為0.5～5.0μg/ml。探針的任何內(nèi)在物理特性均不影響其使用濃度，但受不同類型標(biāo)記物的固相支持物的非特異結(jié)合特性的影響。