1.抗活性Arf 6，小鼠單克l隆抗l體（貨號(hào)26918）：一小瓶– 22 μL（1

含50％甘油和0.05％疊氮l化鈉的PBS（pH 7.4）中的濃度（mg / ml）。 該抗l體特異性識(shí)別所有脊椎動(dòng)物的Arf 6-GTP。

2.蛋白A / G瓊脂糖（目錄號(hào)30301）：一小瓶– 400 μL 50％漿液。

3. 5X測(cè)定/裂解緩沖液（目錄號(hào)30302）：一瓶– 30 mL的250 mM Tris-HCl，pH 8，750mM NaCl，50 mM MgCl2，5 mM EDTA，5％Triton X-100。

4.抗Arf 6，兔多克l隆抗l體（貨號(hào)21032）：一小瓶– 100 μL（1 mg / ml）

pH 7.4的PBS中含有50％的甘油。

5. 100 XGTPγS（目錄號(hào)30303）：1瓶– 100 μl，10 mM，使用5 μLGTPγS標(biāo)記0.5 mL細(xì)胞裂解液。

6. 100 X GDP（產(chǎn)品目錄號(hào)30304）：一個(gè)樣品瓶– 100 μl，100 mM，使用5 μL GDP標(biāo)記0.5 mL細(xì)胞裂解物。

陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照的體外GTPγS/ GDP蛋白質(zhì)上樣量

注意：體內(nèi)細(xì)胞刺激將激l活可用Arf 6的大約10％，而體外GTPγS蛋白負(fù)載將激l活A(yù)rf 6的將近90％。

1，將0.5 ml每種細(xì)胞提取物等分到兩個(gè)微量離心管中（或使用1 μg純化的Arf 6蛋白）。

2，向每個(gè)試管中加入20 μl 0.5 M EDTA（終濃度為20 mM）。

3，將5 μl 100 XGTPγS（至100 μM，終濃度）加到一個(gè)試管中（陽(yáng)性對(duì)照）。

4，在第二個(gè)試管中加入5 μl 100 X GDP（至1 mM，終濃度）（陰性對(duì)照）。

5，在攪拌下將試管在30°C孵育30分鐘。

6，通過(guò)將試管放在冰上并添加32.5 μl 1 M MgCl2（至60 mM，終濃度）來(lái)停止加載。

測(cè)定步驟

I.主動(dòng)Arf 6下拉分析

1.將0.5 – 1 mL細(xì)胞裂解液等分到微量離心管中。

2.使用1X分析/裂解緩沖液將每個(gè)樣品的體積調(diào)整為1 mL。

3.在管中加入1 μl抗活性Arf 6單克l隆抗l體。

4.通過(guò)渦旋或滴定徹底重懸蛋白A / G瓊脂糖珠漿。

5.快速向每個(gè)管中添加20 μL重懸浮的珠漿。

6.輕輕攪拌將試管在4°C下孵育1小時(shí)。

7.通過(guò)以5,000 x g離心1分鐘來(lái)沉淀小珠。

8.吸出并丟棄上清液，確保不要干擾/除去珠粒。

9.用0.5 mL的1X Assay / Lysis Buffer洗滌磁珠3次，每次離心并吸出。

10.后一次洗滌后，將珠粒沉淀并小心除去所有上清液。

11.將磁珠沉淀重懸于20 μL 2X還原SDS-PAGE樣品緩沖液中。

12.將每個(gè)樣品煮沸5分鐘。

13.以5,000 x g的速度離心每個(gè)樣品10秒鐘。