PCR出現(xiàn)假陰性

不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶。PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有①模板核酸的制備，②引物的質(zhì)量與特異性，③酶的質(zhì)量及Br乙錠的使用， ④PCR循環(huán)條件。尋找原因亦應(yīng)針對上述環(huán)節(jié)進(jìn)行分析研究。

模板：①模板中含有雜蛋白質(zhì)，②模板中含有Taq酶抑制1劑，③模板中蛋白質(zhì)沒有消化除凈，特別是染色體中的組蛋白，④在提取制備模板時(shí)丟失過多，或吸入酚。⑤模板核酸變性不徹底。在酶和引物質(zhì)量好時(shí)，不出現(xiàn)擴(kuò)增帶，極有可能是標(biāo)本的消化處理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應(yīng) 固定不宜隨意更改。

PCR有哪些應(yīng)用領(lǐng)域？

基因表達(dá)

通?？赏ㄟ^PCR來檢測不同細(xì)胞類型、組織和生物體在特定時(shí)間點(diǎn)的基因表達(dá)差異。首先，從目標(biāo)樣品中分離出RNA并將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。隨后，通過由PCR擴(kuò)增的cDNA數(shù)量，確定mRNA的初始水平。這一過程也被稱為逆轉(zhuǎn)錄PCR。

終點(diǎn)PCR 可通過凝膠里的擴(kuò)增產(chǎn)物條帶強(qiáng)度對RNA的表達(dá)進(jìn)行定量（一種半定量方法）。例如，對起始cDNA進(jìn)行連續(xù)稀釋并擴(kuò)增。通過凝膠電泳使不同起始量的終點(diǎn)PCR得率可視化，然后對條帶強(qiáng)度進(jìn)行定量，并以管家基因?yàn)閰⒄者M(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，預(yù)估擴(kuò)增靶點(diǎn)的相對表達(dá)水平。如今，終點(diǎn)PCR已基本被實(shí)時(shí)PCR 或qPCR 取代了，因?yàn)樗鼈兛色@得更可靠和更準(zhǔn)確的基因表達(dá)定量結(jié)果。

梯度PCR儀

把一次性PCR擴(kuò)增可以設(shè)置一系列不同的退火溫度條件（溫度梯度），通常12鐘溫度梯度，這樣的儀器就叫梯度PCR儀。

工作模式和原理同普通PCR儀一樣，它出了又普通PCR儀的功能外還多了一個(gè)梯度退火功能。DNA部分片段的擴(kuò)增對溫度的控制精度要求特別高，不同的DNA部分片段其退火溫度不一樣，通過計(jì)算DNA部分片段中的CG堿基的含量只能初步的判斷出zui優(yōu)退火溫度在 5℃范圍內(nèi)，如果用普通PCR儀進(jìn)行研究，需重復(fù)擴(kuò)增很多次，然后做電泳進(jìn)行分析來確定zui優(yōu)退火溫度。而梯度PCR儀則只需要一次就可以完成，在節(jié)省了時(shí)間的同時(shí)提高了實(shí)驗(yàn)的可靠性和準(zhǔn)確性。主要用于研究未知DNA退火溫度的擴(kuò)增，這樣節(jié)約成本的同時(shí)也節(jié)約了時(shí)間和經(jīng)費(fèi)。在不設(shè)置梯度的情況下，梯度PCR儀也可以做普通PCR擴(kuò)增。

該儀器主要應(yīng)用于科研，教學(xué)機(jī)構(gòu)，醫(yī)學(xué)臨床研究，高等院校，病毒分析，疾控中心等。