多種探針標記檢測系統(tǒng)

基于地高3辛、生物素和熒光標記分子的標記和檢測系統(tǒng)是常見的原位雜交檢測方法。

熒光標記檢測常為直接探針標記方法，如在dUTP/UTP/ddUTP上連接Fluorescein后進行核酸標記。由于標記在核酸上的熒光分子必須經(jīng)受雜交和洗脫過程中的考驗，以及熒光分子易于衰減，其檢測靈敏度受到一定的影響。但對熒光分子的直接檢測呈現(xiàn)的背景較低。

就DNA探針和RNA探針的比較，DNA探針在雜交過程中會出現(xiàn)探針雙鏈之間退火的可能，也更傾向于在溶液中形成大分子的探針聚合體，從而影響其滲透能力。而RNA 探針的應用，將提高DNA-RNA雜交子的熱穩(wěn)定性。

Tips：RNA探針因其單鏈、高分子結(jié)合力、可適應高溫雜交的特性，其檢測特異性和靈敏度均優(yōu)于DNA探針。常用的RNA探針標記方法為構(gòu)建質(zhì)粒后進行轉(zhuǎn)率合成。通過PCR擴增的方法，可以更方便地進行RNA探針的制備；RNA探針合成后，還需驗證其對目標片段檢測的靈敏度和特異性。

雜交流程

雜交液的成分主要影響了核酸雜交的復性動力學和熱穩(wěn)定性。雜交液的基礎(chǔ)成分為：Denhardt’s溶液（Ficoll，BSA，PVP），異源核酸（如鯡精3子DNA/tRNA/競爭DNA），磷酸鈉，EDTA，SDS，鹽離子，甲酰胺和硫酸葡聚糖，以及雜交探針。不同的應用中進行雜交溫度、pH、鹽離子、甲酰胺、探針濃度等條件的優(yōu)化。常用的pH范圍為6.5~7.5，較高的pH值有助于提高雜交的嚴謹性。

在條件都得到滿足的情況下，雜交的成敗就取決于保溫時間。時間短了，雜交反應不完成；時間長了也無益，會引起非特異結(jié)合增多。一般雜交反應要進行20h左右。1966年Britten和Kohne推薦用Cot =值來計算雜交反應時間。Cot 值實際上是雜交液中單鏈起始濃度（Co）和 反應時間（t）的乘積。實驗表明Cot =100時，雜交反應基本完成。Cot=0，基本上沒有雜交。例如在液相雜交中未標記的DNA 400μg/ml（按單股DNA每微克 紫外吸收值為0.024計算，總的吸收值為 9.6），如果反應時間為21h，那么對于未標記的DNA來說，Cot =9.6/21 =100.8,，雜交完成了。對標記DN A（濃度為0.1μg/ml）來說Cot值為0.05，這就充分排除了標記DNA的自我復性。Tm值25℃時雜交zui佳，所以首先要根據(jù)公式（4）計算雜交體Tm 值。由此式可見，通過調(diào)節(jié)鹽濃度、甲酰胺濃度和雜交溫度來控制所需的嚴格性。