武漢紐斯特生物科技有限公司（WuhanNewEastBiotechonologyCo.Ltd），系美國生命科學試劑供應商美國NewEastBio在中國的子公司。公司位于武漢東湖高新技術開發(fā)區(qū)光谷生物城.美國NewEastBio專注于生命科學和生物技術領域，主要產品有小分子、ELISA試劑盒、蛋白等，與世界高校和研究所、世界大制藥公司、生物科技公司和醫(yī)院等客戶建立了長期穩(wěn)定的合作關系，產品銷往全球。

NewEast Biosciences Arf6激l活檢測試劑盒基于特定于配置的單克l隆抗l體和Arf6特異性兔多克l隆抗l體，該抗l體特異性識別Arf6-GTP，但不能識別Arf6-GDP。 鑒于單克l隆抗l體對其抗原的高度親和力，可以在短時間內進行激l活測定。 該測定法可提供可靠的結果，并具有一致的可重復性。

電泳與轉移

1.將15 μL /孔的下拉上清液加到聚丙l烯酰胺凝膠（17％）中。 而且，建議包含預先染色的MW標準（作為步驟3中成功轉移的指標）。

2.按照制造商的說明執(zhí)行SDS-PAGE。

3.按照制造商的說明將凝膠蛋白轉移到PVDF或硝l酸纖維素膜上。

試劑制備

1X Assay/Lysis Buffer：實驗前用去離子水將5X的Assay/Lysis緩沖液稀釋成1X的緩沖液，并在使用前加入蛋白酶抑制l劑如1 mM PMSF, 10 μg/mL leupeptin（亮肽素），或 10 μg/mL aprotinin（抑肽酶）。

樣品處理

貼壁細胞

1. 培養(yǎng)細胞密度達到大約80%-90%之間（直徑10 cm培養(yǎng)皿，~107個細胞），并用活性劑或抑制l劑進行處理。

2. 吸去培養(yǎng)基并用冰冷的PBS洗滌兩次。

3. 向細胞中加入1X Assay/Lysis緩沖液（每個直徑10cm的組織培養(yǎng)皿中加入0.5-1mL）。

4. 將培養(yǎng)皿放置于冰上處理10-20分鐘。

5. 用細胞刮棒把細胞從培養(yǎng)皿下分離下來。

6. 將細胞裂解物轉入合適的管中并放置于冰上。

7. 如果核發(fā)生裂解，細胞裂解物可能會變得非常的粘稠并且難以吸取。當這種情況出現時，將細胞裂解物用27?的注射l器針頭來回吸取3-4次，以破壞基因組DNA，從而避免上述情況的出現。

8. 4°C 12000 g, 離心10 min。

9. 收集上清（~1-2 mg總蛋白）并放置于冰上使用。如果樣品不立即使用，請將處理后的樣品存放于-70°C條件下。

武漢紐斯特生物科技有限公司（WuhanNewEastBiotechonologyCo.Ltd），系美國生命科學試劑供應商美國NewEastBio在中國的子公司。美國NewEastBio專注于生命科學和生物技術領域，主要產品有小分子、ELISA試劑盒、蛋白等。

懸浮細胞

1.培養(yǎng)細胞并根據需要用活化劑或抑制l劑刺激。

2.進行細胞計數，然后通過離心沉淀細胞。

3.吸出培養(yǎng)基，并用冰冷的PBS洗滌兩次。

4.完全除去PBS洗滌液，然后向細胞沉淀中加入冰冷的1X分析/裂解緩沖液

   （每1 x 107池0.5 – 1 mL）。

5.通過重復移液裂解細胞。

6.將裂解物轉移至適當大小的試管中，并置于冰上。

7.如果發(fā)生核裂解，則細胞裂解液可能變得非常粘稠，難以移液。如果這

   發(fā)生時，裂解液可通過27?號注射l器針頭3-4次以剪切

   基因組DNA。

8.通過離心10分鐘（在4°C下為12,000 x g）清除裂解物。

9.收集上清液并將樣品保存在冰上以備立即使用，或速凍并保存在-

   70°C以備將來使用。

陽性和陰性對照的體外GTPγS/ GDP蛋白質上樣量

    注意：體內刺激細胞會激l活大約10％的可用Rab35，而

    體外GTPγS蛋白負載將激l活近90％的Rab35。

1.將0.5 ml每種細胞提取物等分到兩個微量離心管中（或使用1 μg純化的Rab35蛋白）。

2.向每個試管中加入20 μl 0.5 M EDTA（至20 mM終濃度）。

3.將5 μl 100 XGTPγS（至100 μM，終濃度）加到一個試管中（陽性對照）。

4.在第二個試管中加入5 μl 100 X GDP（至1 mM，終濃度）（陰性對照）。

5.在攪拌下將試管在30°C孵育30分鐘。

6.通過將試管放在冰上并添加32.5 μl 1 M MgCl2（至60 mM）。