Hot Start PCR的原理

Hot Start PCR法是提高PCR特異性的重要方法之一。這種方法可以防止在PCR反應(yīng)第yi步驟因引物的錯(cuò)配或引物二聚體的形成而導(dǎo)致的非特異性擴(kuò)增，從而可以提高目的DNA部分片段的擴(kuò)增效率。TaKaRa Taq Hot Start Version，TaKaRa Ex Taq Hot Start Version，TaKaRa LA Taq Hot Start Version，PrimeSTAR HS DNA polymerase，MightyAmp DNA Polymerase是抗1體和DNA聚合酶的混合制品?？?體在高溫加熱前與聚合酶相結(jié)合，抑制聚合酶的活性。在PCR反應(yīng)zui初的DNA變性步驟，抗1體變性，聚合酶活性恢復(fù)。

反向PCR( Inverse PCR, IPCR術(shù)

原理:反向PCR是克1隆已知序列旁側(cè)序列的一種方法，主要原理是用一種在已知序列中無切點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶消化基因組DNA.后酶切片段自身環(huán)化.以環(huán)化的DNA作為模板，用一對與已知序列兩端特異性結(jié)合的引物，擴(kuò)增夾在中間的未知序列。該擴(kuò)增產(chǎn)物是線性的DNA的部分片段，大小取決于.上述限制性內(nèi)切酶在已知基閑側(cè)翼DNA序列內(nèi)部的酶切位點(diǎn)分布情況。用不同的限制性內(nèi)切酶消化，可以得到大小不同的模板DNA，再通過反向PCR獲得未知片段。

該方法的不足是:①需要從許多酶中選擇限制酶，或者說必須選擇一種合適的酶進(jìn)行酶切才能得到合理大小的DNA部分片段。這種選擇不能在非酶切位點(diǎn)切斷靶DNA。②大多數(shù)有核基因組含有大量中度和高度重復(fù)序列，而在YAC或Cosmid中的未知功能序列中有時(shí)也會(huì)有這些序列，這樣，通過反向PCR得到的探針就有可能與多個(gè)基因序列雜交。

差示PCR (differential PCR, d -PCR)技術(shù)

d-PCR可以定量檢測標(biāo)本靶基因的拷貝數(shù)。它是將目的基因和一個(gè)單拷貝的參照基因置于一個(gè)試管中進(jìn)行PCR擴(kuò)增。電泳分離后呈兩條區(qū)帶,比較兩條區(qū)帶的豐度，或在引物5°-端標(biāo)記上放1射性核素后.通過檢測兩條區(qū)帶放1射性強(qiáng)度即可測出目的基因的拷貝數(shù)。

定量PCR(quantitative PCR, qPCR)技術(shù)

qPCR技術(shù)是用合成的RNA作為內(nèi)標(biāo)來檢測PCR擴(kuò)增目的mRNA的量,涉及目的mRNA和內(nèi)標(biāo)用相同的引物共同擴(kuò)增.但擴(kuò)增出不同大小片段的產(chǎn)物.可容易地電泳分離。一種內(nèi)標(biāo)可用于定量多種不同目的mRNA。qPCR可用 于研究基因表達(dá)。能提供特定DNA基因表達(dá)水平的變化.在癌1癥、代謝紊亂及自身免1疫性疾病的診斷和分析中很有價(jià)值。