低溫生物菌種的原理

菌種保藏有多種方法，其原理大多大同小異，主要是運(yùn)用一些方式盡量降低生物體內(nèi)的代謝，達(dá)到延長生命，減少變異的目的。通常采用的方法為低溫、缺氧、干燥。

低溫主要對菌種產(chǎn)生兩方面的影響，首先，較低的溫度可以減緩機(jī)體細(xì)胞的酶活，降低新陳代謝，達(dá)到保藏菌種的目的。其次，低溫同時(shí)會導(dǎo)致菌體誘發(fā)菌絲自溶機(jī)制，如果降溫過程失誤，同樣會造成機(jī)體的機(jī)械損傷和溶質(zhì)損傷。

微生物具有容易變異的特性，因此，在保藏過程中，必須使微生物的代謝處于不活躍或相對靜止的狀態(tài)，才能在一定的時(shí)間內(nèi)使其不發(fā)生變異而又保持生活能力。

低溫、干燥和隔絕空氣是使微生物代謝能力降低的重要因素，所以，菌種保藏方法雖多，但都是根據(jù)這三個(gè)因素而設(shè)計(jì)的。

                                                       低溫生物菌種貯存的方式

1.冷凍真空干燥法。將已培養(yǎng)、生長豐富的菌體或孢子懸浮于滅菌的、卵白、脫脂奶制成菌懸液，將懸液以無菌操作分裝于滅菌的玻璃安瓿瓶中，每管約0.3-0.5毫升，然后用耐壓橡皮管與冷凍干燥裝置連接，安瓿瓶放在冷凍槽中于-30℃至-40℃迅速冷凍，并在冷凍狀態(tài)下抽空干燥，并在真空狀態(tài)下熔封安瓿，在-20℃保存，一般可保存十年以上，但成本較高。

     2.液氮超低溫保藏法。首先將要保藏的菌種制成菌懸液備用；其次，準(zhǔn)備安瓿瓶，每瓶加入0.8毫升冷凍保護(hù)劑10%（體積比）甘油蒸餾水溶液，塞棉塞滅菌（1公斤/平方厘米，5分鐘）。無菌檢查后，接入要保藏的菌種，火焰熔封瓶口，檢查是否漏氣，將封好口的安瓿瓶放在凍結(jié)器內(nèi)，以每分鐘下降1℃的速度緩慢降溫，使保藏品逐步均勻地凍結(jié)，直至-35℃，以后凍結(jié)速度就不需控制，安瓿凍結(jié)后立即放入液氮罐內(nèi)，在-150至-196℃保藏，該法只有少數(shù)科研院所使用。

低溫生物菌種的冷凍干燥保藏法

(1)準(zhǔn)備安瓿管用于冷凍干燥菌種保藏的安瓿管宜采用中性玻璃制造，形狀可用長頸球形底的，亦稱淚滴型安瓿管(圖Ⅶ-15)，大小要求外徑6-7.5mm，長105mm，球部直徑9-11mm，壁厚0.6-1.2mm。也可用沒有球部的管狀安瓿管。塞好棉塞，1.05kg/cm2>，121.3℃滅菌30分鐘，備用。

(2)準(zhǔn)備菌種，用冷凍干燥法保藏的菌種，其保藏期可達(dá)數(shù)年至十?dāng)?shù)年，為了在許多年后不出差錯(cuò)，故所用菌種要特別注意其純度，即不能有雜菌污染，然后在適培養(yǎng)基中用適溫度培養(yǎng)，使培養(yǎng)出良好的培養(yǎng)物。細(xì)菌和酵母的菌齡要求超過對數(shù)生長期，若用對數(shù)生長期的菌種進(jìn)行保藏，其存活率反而降低。一般，細(xì)菌要求24-48小時(shí)的培養(yǎng)物;酵母需培養(yǎng)3天;形成孢子的微生物則宜保存孢子;線菌與絲狀真菌則培養(yǎng)7-10天。

(3)制備菌懸液與分裝以細(xì)菌斜面為例，用脫脂牛乳2ml左右加入斜面試管中，制成濃菌液，每支安瓿管分裝0.2ml。

(4)冷凍冷凍干燥器有成套的裝置出售，價(jià)值昂貴，此處介紹的是簡易方法與裝置，可達(dá)到同樣的目的。

將分裝好的安瓿管放低溫冰箱中冷凍，無低溫冰箱可用冷凍劑如干冰(固體CO2>)酒精的液或干冰酮液，溫度可達(dá)-70℃。將安瓿管插入冷凍劑，只需冷凍4-5分鐘，即可使懸液結(jié)冰。