等溫核酸試劑盒

重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)是近年來建立起的一種新的核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，具有操作簡單、靈敏度高、特異性強(qiáng)、可在短時(shí)間內(nèi)快速擴(kuò)增出目的片段等優(yōu)點(diǎn)，在動(dòng)物疾病早期診斷、現(xiàn)地檢測(cè)、進(jìn)出口快速檢疫等方面具有良好的應(yīng)用前景。通過綜述RPA技術(shù)及其在病毒性豬病快速檢測(cè)中的應(yīng)用研究進(jìn)展，以期為更好地防控豬病提供參考。

RPA反應(yīng)的適宜溫度在37℃~42℃之間，無需變性，常溫下即可反應(yīng)，大大加快了PCR的速度。并且由于不需要溫控設(shè)備，RPA可以真正實(shí)現(xiàn)便攜式的快速核酸檢測(cè)。RPA檢測(cè)的靈敏度很高，能夠?qū)⒑哿康暮怂?/span>（尤其是DNA）模板擴(kuò)增到可檢出水平，從單個(gè)模板分子得到大約1012擴(kuò)增產(chǎn)物。無需復(fù)雜樣品處理，即可實(shí)地檢測(cè)；既可擴(kuò)增DNA也可擴(kuò)增RNA，省去額外的cDNA合成步驟；檢測(cè)方式多樣：終點(diǎn)檢測(cè)、對(duì)擴(kuò)增過程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控或通過側(cè)流層析試紙條（LFD）讀取結(jié)果。

試劑盒包括兩類：①.TwistAmp凍干研發(fā)試劑盒（包括TwistAmp Basic試劑盒、TwistAmp exo 試劑盒和TwistAmp nfo 試劑盒共三種）；②. TwistAmp液態(tài)研發(fā)試劑盒（包括TwistAmp Liquid Basic 試劑盒和TwistAmp Liquid exo 試劑盒共兩種）

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如何提高擴(kuò)增曲線的可重復(fù)性?

優(yōu)化擴(kuò)增曲線考慮以下因素: 對(duì)于低拷貝數(shù)模板，不穩(wěn)定擴(kuò)增可能是因?yàn)檫_(dá)到檢測(cè)限或者是反應(yīng)混勻程度不同（未混勻的反應(yīng)擴(kuò)增效率不佳）。另外，在低溫情況下存貯，重組酶和輔助蛋白在50%甘油情況下形成沉淀,也是可能導(dǎo)致不穩(wěn)定擴(kuò)增的原因。所以，20x核心反應(yīng)mix在室溫下解凍并震蕩渦旋將使其成為液體，不影響其功能,并且有效提高擴(kuò)增效率。不穩(wěn)定擴(kuò)增也可能是因?yàn)閙aster mix量不足，在加入體系前，用戶必須保證震蕩后20x核心反應(yīng)組分均一。

數(shù)字PCR技術(shù)是第三代PCR技術(shù)，是一種核酸分子定量的檢測(cè)方法。現(xiàn)階段，核酸分子的定量有三種方法：光度法基于核酸分子的吸光度來定量；實(shí)時(shí)熒光定量PCR基于Ct值，即指可以檢測(cè)到熒光值對(duì)應(yīng)的循環(huán)數(shù)；數(shù)字PCR作為新定量技術(shù)，主要采用當(dāng)前分析化學(xué)熱門研究領(lǐng)域的微流控或微滴化方法，借助專門設(shè)備將50微升左右核酸溶液樣本大量稀釋后，分割成了近10萬個(gè)液滴分散至芯片的微反應(yīng)器或微滴中，單一液滴為獨(dú)立反應(yīng)單元，每個(gè)反應(yīng)器的核酸模板數(shù)少于或者等于1個(gè)。