污染的監(jiān)測(cè)

一個(gè)好的實(shí)驗(yàn)室，要時(shí)刻注意污染的監(jiān)測(cè)，考慮有無(wú)污染是什么原因造成的污染，以便采取措施，防止和消除污染。

1、陽(yáng)性對(duì)照：在建立PCR反應(yīng)實(shí)驗(yàn)室及一般的檢驗(yàn)單位都應(yīng)設(shè)有PCR陽(yáng)性對(duì)照，它是PCR反應(yīng)是否成功、產(chǎn)物條帶位置及大小是否合乎理論要求的一個(gè)重要的參考標(biāo)志。陽(yáng)性對(duì)照要選擇擴(kuò)增度中等、重復(fù)性好，經(jīng)各種鑒定是該產(chǎn)物的標(biāo)本，如以重組質(zhì)粒為陽(yáng)性對(duì)照，其含量宜低不宜高（100個(gè)拷貝以下）。但陽(yáng)性對(duì)照尤其是重組質(zhì)粒及高濃度陽(yáng)性標(biāo)本，其對(duì)檢測(cè)或擴(kuò)增樣品污染的可能性很大。因而當(dāng)某一PCR試劑經(jīng)自己使用穩(wěn)定，檢驗(yàn)人員心中有數(shù)時(shí)，在以后的實(shí)驗(yàn)中可免設(shè)陽(yáng)性對(duì)照。

2、陰性對(duì)照：每次PCR實(shí)驗(yàn)務(wù)必做陰性對(duì)照。它包括：

  （1）標(biāo)本對(duì)照：被檢的標(biāo)本是血1清就用鑒定后的正常血1清作對(duì)照；被檢的標(biāo)本是組織細(xì)胞就用相應(yīng)的組織細(xì)胞作對(duì)照。

  （2）試劑對(duì)照：在PCR試劑中不加模板DNA或RNA,進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以監(jiān)測(cè)試劑是否污染。

3、重復(fù)性試驗(yàn)。

4、選擇不同區(qū)域的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

隨機(jī)引物擴(kuò)增技術(shù)(arbitrary primedPCR, AP- PCR)

AP-PCR技術(shù)通過(guò)隨意設(shè)計(jì)或選擇一個(gè)非特異性引物.在PCR反應(yīng)體系中.首先在不嚴(yán)格條件下使引物與模板中許多序列通過(guò)錯(cuò)配而復(fù)性。如果在兩條單鏈上相距一定距離有反向復(fù)性引物存在,則可經(jīng)Taq酶的作用使引物延伸而發(fā)生DNA部分片段的擴(kuò)增。經(jīng)一至數(shù)輪不嚴(yán)格條件下的PCR循環(huán)后，再于嚴(yán)格條件下進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增的產(chǎn)物經(jīng)DNA測(cè)序凝膠電泳分離后.經(jīng)放1射性自顯影或熒光顯示即可得到DNA指紋圖。AP-PCR用于腫1瘤的抑制基因、癌基因的分離;菌1種、菌株及不同物種的鑒定;遺傳作圖;不同分化程度或某些不同狀態(tài)下的組織的基因表達(dá)差異等方面的研究。

差示PCR (differential PCR, d -PCR)技術(shù)

d-PCR可以定量檢測(cè)標(biāo)本靶基因的拷貝數(shù)。它是將目的基因和一個(gè)單拷貝的參照基因置于一個(gè)試管中進(jìn)行PCR擴(kuò)增。電泳分離后呈兩條區(qū)帶,比較兩條區(qū)帶的豐度，或在引物5°-端標(biāo)記上放1射性核素后.通過(guò)檢測(cè)兩條區(qū)帶放1射性強(qiáng)度即可測(cè)出目的基因的拷貝數(shù)。

定量PCR(quantitative PCR, qPCR)技術(shù)

qPCR技術(shù)是用合成的RNA作為內(nèi)標(biāo)來(lái)檢測(cè)PCR擴(kuò)增目的mRNA的量,涉及目的mRNA和內(nèi)標(biāo)用相同的引物共同擴(kuò)增.但擴(kuò)增出不同大小片段的產(chǎn)物.可容易地電泳分離。一種內(nèi)標(biāo)可用于定量多種不同目的mRNA。qPCR可用 于研究基因表達(dá)。能提供特定DNA基因表達(dá)水平的變化.在癌1癥、代謝紊亂及自身免1疫性疾病的診斷和分析中很有價(jià)值。

PCR技術(shù)不僅可用于基礎(chǔ)研究，還適用于日常的臨床診斷、法醫(yī)學(xué)調(diào)查和農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究。這些應(yīng)用要求可靠的性能、及時(shí)的靈敏度和嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)。因此，所使用的PCR儀和PCR試劑必須符合這些要求和目的。

分子診斷應(yīng)用包括基因檢測(cè)、致癌突變檢測(cè)以及感1染性疾病檢測(cè)。在法醫(yī)學(xué)中，利用 PCR進(jìn)行人類(lèi)身份鑒定是通過(guò)對(duì)特別的短串聯(lián)重復(fù)序列（STR）進(jìn)行擴(kuò)增而區(qū)分個(gè)體的。在農(nóng)業(yè)學(xué)中，PCR在食物病原體檢測(cè)、育種植物基因分型和 GMO測(cè)試中具有重要作用。