1.抗活性Arf 6，小鼠單克l隆抗l體（貨號(hào)26918）：一小瓶– 22 μL（1

含50％甘油和0.05％疊氮l化鈉的PBS（pH 7.4）中的濃度（mg / ml）。 該抗l體特異性識(shí)別所有脊椎動(dòng)物的Arf 6-GTP。

2.蛋白A / G瓊脂糖（目錄號(hào)30301）：一小瓶– 400 μL 50％漿液。

3. 5X測(cè)定/裂解緩沖液（目錄號(hào)30302）：一瓶– 30 mL的250 mM Tris-HCl，pH 8，750mM NaCl，50 mM MgCl2，5 mM EDTA，5％Triton X-100。

4.抗Arf 6，兔多克l隆抗l體（貨號(hào)21032）：一小瓶– 100 μL（1 mg / ml）

pH 7.4的PBS中含有50％的甘油。

5. 100 XGTPγS（目錄號(hào)30303）：1瓶– 100 μl，10 mM，使用5 μLGTPγS標(biāo)記0.5 mL細(xì)胞裂解液。

6. 100 X GDP（產(chǎn)品目錄號(hào)30304）：一個(gè)樣品瓶– 100 μl，100 mM，使用5 μL GDP標(biāo)記0.5 mL細(xì)胞裂解物。

免l疫印跡和檢測(cè)（所有步驟均在室溫下攪拌）

1.在電印跡步驟之后，將PVDF膜浸入100％甲l醇中15秒鐘，然后使其在室溫下干燥5分鐘。注意：如果使用硝l酸纖維素代替PVDF，則應(yīng)跳過(guò)此步驟。

2.在室溫下不斷攪拌下，在TBST中用5％脫脂奶粉或3％BSA封閉膜1小時(shí)。

將膜與抗Arf 6兔多克l隆抗l體在5％脫脂奶粉或3％BSA / TBST中以1：50?1000（取決于樣品中Arf 6蛋白質(zhì)的量）新鮮稀釋?zhuān)跤?-在室溫下持續(xù)攪拌2小時(shí)或過(guò)夜4oC。

3.用TBST將印跡的膜清洗3次，每次5分鐘。

4.將膜與二抗（例如山羊抗兔IgG，HRP偶聯(lián)物）一起孵育，在室溫下以恒定的比例在5％脫脂奶粉或3％BSA / TBST中以1：1000的比例新鮮稀釋。攪動(dòng)。

5.用TBST將印跡的膜清洗3次，每次5分鐘。

6.使用您選擇的檢測(cè)方法，例如ECL。

 1.抗活性的Arl1，小鼠單克l隆抗l體（貨號(hào)26924）：一小瓶–溶于pH 7.4的PBS中的22 μL（1mg / ml），含有50％甘油和0.05％疊氮l化鈉。該抗l體特異性識(shí)別所有脊椎動(dòng)物的Arl1-GTP。

4.抗Arl1，小鼠單克l隆抗l體（目錄號(hào)26056）：一小瓶– 100 μL（1 mg / ml）

5. 100 XGTPγS（貨號(hào)30303）：1瓶– 100 μl，10 mM，使用5 μLGTPγSGTP標(biāo)記的0.5 mL細(xì)胞裂解物。

6. 100 X GDP（產(chǎn)品目錄號(hào)30304）：一個(gè)樣品瓶– 100 μl，100 mM，使用5 μL GDP

GDP標(biāo)記的0.5 mL細(xì)胞裂解物。

1.刺激的和非刺激的細(xì)胞裂解液

2.蛋白酶抑制l劑

3. 4°C管搖桿或搖床

4. 0.5 M EDTA，pH8.0

5. 1 M氯化鎂

6. 2倍還原SDS-PAGE樣品緩沖液

7.電泳和免l疫印跡系統(tǒng)

8.免l疫印跡洗滌緩沖液，例如TBST（10 mM Tris-HCl，pH 7.4，0.15 M NaCl，0.05％Tween-20）

9.免l疫印跡封閉緩沖液（TBST包含5％脫脂奶粉或3％BSA）

10. PVDF或硝l酸纖維素膜

11.二抗

12. ECL檢測(cè)試劑

?1X測(cè)定/裂解緩沖液：短暫混合5X儲(chǔ)備液，并在去離子水中稀釋至1X。 在使用前，添加蛋白酶抑制l劑，例如1 mM PMSF，10 μg / mL亮肽素和10 μg / mL抑肽酶。

Arl1激l活試驗(yàn)。純化的GST標(biāo)記的Arl1蛋白用抗活性Arl1單克l隆抗l體（Cat。#26924）用GDP（車(chē)道1）或GTPγS（車(chē)道2）處理后，用抗Arl1單克l隆抗l體（Cat）進(jìn)行印跡。#26056年）。顯示Arl1蛋白輸入控制在底部面板中。

產(chǎn)品描述

Arf樣蛋白1（Arl1）是調(diào)節(jié)性gtpase家族中的一員，位于Ras中GTPases的超家族，在真核生物中具有高度保守的同源基因。Arl1至關(guān)重要用于果蠅和秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)的早期胚胎發(fā)育。Arl1在一級(jí)序列，細(xì)胞位置和功能（膜交通的調(diào)節(jié)）到Arf1–6甚至共享幾個(gè)共同的有約束力的合作伙伴。除了在膜交通中的作用高爾基/跨高爾基網(wǎng)絡(luò)，有報(bào)道表明Arl1可能在離子穩(wěn)態(tài)中起作用酵母。

目前還沒(méi)有直接測(cè)定Arl1-gtpase活性的方法。NewEast Biosciences Arl1激l活檢測(cè)試劑盒是基于特定構(gòu)型的單克l隆抗l體特異性識(shí)別Arl1 GTP，但不識(shí)別Arl1 GDP的抗l體。鑒于單克l隆抗l體對(duì)其抗原，活化試驗(yàn)可在短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行。這個(gè)分析結(jié)果可靠，重現(xiàn)性一致。