全轉(zhuǎn)錄組測序    

全轉(zhuǎn)錄組是指特定組織或細胞在特定狀態(tài)下所有轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的總和，包括mRNA和各種noncoding RNA?；瘜W鍵合固定相，根據(jù)鍵合的基團不同可用于反相或正相色譜，其中常用的是十八烷基硅l烷(又稱ODS)鍵合硅膠，可用于反相色譜或離子對色譜離子交換填料，用于離子交換色譜，是有一定孔徑的大孔填料，用于排阻色譜。我們知道生物體本身的轉(zhuǎn)錄過程是一個動態(tài)變化且十分復雜的分子作用網(wǎng)絡，如果只是對某個單一RNA分子的研究，有時并不能準確的發(fā)現(xiàn)分子作用機制。而競爭性內(nèi)源RNA(ceRNA)理論闡述了一種全新的轉(zhuǎn)錄調(diào)控模式：ceRNA（包括lncRNA、circRNA、mRNA、假基因等）分子能夠通過miRNA應答元件（microRNA Respe Element, MRE）競爭性地結(jié)合相同的miRNA來調(diào)節(jié)彼此的表達水平。舉個例子：miRNA會導致基因沉默現(xiàn)象發(fā)生，而如果lncRNA競爭性結(jié)合了miRNA，從而影響了miRNA基因沉默功能實現(xiàn)。

      ceRNA是目前轉(zhuǎn)錄調(diào)控領域的熱點內(nèi)容之一，通過全轉(zhuǎn)錄組研究能夠系統(tǒng)性的闡述ceRNA的分子作用機制。此外，Illumina還捕獲了未翻譯的區(qū)域，這是NimbleGen和安捷倫平臺無法靶定的。目前對全轉(zhuǎn)錄組簡便的方法就是構(gòu)建2個測序文庫分別進行測序。標準的生物信息學分析能夠得到mRNA、lncRNA、circRNA、miRNA各自的研究內(nèi)容，靶向調(diào)控網(wǎng)絡、ceRNA網(wǎng)絡、共表達網(wǎng)絡分析可以將這幾種RNA聯(lián)合起來分析，從而發(fā)現(xiàn)新的調(diào)控網(wǎng)絡模型。去除rRNA的鏈特異性文庫，含有的RNA信息含量十分豐富，通過測序和生物信息學分析能夠得到mRNA、lncRNA、circRNA的鑒定及注釋信息。不過該文庫構(gòu)建時會進行片段化選擇從而濾掉了small RNA的信息，所以需要另外再構(gòu)建一個small RNA文庫，進行測序分析后可以得到miRNA和其他small RNA的鑒定及注釋信息。全轉(zhuǎn)錄組測序方案路線圖如下所示：

2.引物純化方式有哪些，如何選擇？

◆　脫鹽

寡核苷酸合成后，為了純化寡核苷酸成為天然的DNA結(jié)構(gòu)，首先必須去除保護基團。同一細胞在不同的生長時期及生長環(huán)境下，其基因表達情況是不相同的。通過濃氨水處理，合成的寡核苷酸從固相載體上分離，2-乙氧基--磷酸二脂鍵的保護基團，以及堿基的保護基團基（苯甲酰基和異丁基）被去除，從而形成了天然的DNA結(jié)構(gòu)。然而，必要的去保護步驟完成后，寡核苷酸混合物還包含幾種必須被去除的小分子有機化合物。所有非必須有機化合物被移除的過程通常叫做脫鹽。脫鹽純化可以借助反向硅膠柱進行。盡管脫鹽純化可以移除所有的非必須有機雜質(zhì)，但它不能有效移除合成中產(chǎn)生微量的提前終止的寡核苷酸雜鏈。然而，脫鹽的寡核苷酸還是能夠滿足ＰＣＲ檢測等基礎生物研究。

◆　BioRP / OPC純化

如果寡核苷酸以“三苯”的形式合成，則N-寡核苷酸包含5’-DMT基團，提前終止的寡核苷酸不包含該基團。因為DMT基有強的親脂的特性，有5’-DMT基團的寡核苷酸與反相樹脂有親和性，因此反相親和樹脂通常被用于寡核苷酸的純化。利用反向樹脂和5’－DMT寡核苷酸存在強親和力，但是提前終止的寡核苷酸不包含DMT基團，所以，我們能夠成功的把想要的N-寡核苷酸從提前終止的寡核苷酸雜質(zhì)中分離出來?；蚪M甲l基化水平(MethylationContent)的分析:1。

9.如何計算引物的Tm值？

答：引物設計軟件都可以給出Tm，與引物長度、堿基組成、引物使用緩沖的離子強度有關。

長度為25mer以下的引物，Tm計算公式為：

Tm =            4℃   (G C) 2℃   (A T)

對于更長的寡聚核苷酸，Tm計算公式為：

Tm = 81.5 16.6 x Log10[Na ] 0.41 (%GC) - 600/size

公式中，Size = 引物長度。

Tm的定義：Tm = Temperature at which 50% of a given oligonucleotide is hybridized to its complementary strand. In the absence of destabilizing agents, like formamide or urea, Tm will depend on 3 major parameters: The sequence: a GC-rich sequence has a higher melting temperature. The strand concentration: high oligonucleotide concentrati favor hybrid formation, which results in a higher melting temperature. The salt concentration: high ionic strength results in a higher Tm as cati stabilize the DNA duplexes.

15.測序發(fā)現(xiàn)引物有突變是怎么回事？

答：測序發(fā)現(xiàn)引物區(qū)域有突變，特別是40個堿基以下的引物, 發(fā)生的概率不大，但是肯定也會發(fā)生。用戶一般可以放心，引物序列一般都是通過電腦直接將您的序列COPY到合成儀的，堿基輸錯的機會不多。核酸合成公司一般會有一套控制辦法，預防堿基輸入錯誤。發(fā)生這種突變的原因有很多解釋，人們還沒有辦法解決這個問題。在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以病毒RNA為模板合成cDNA再通過DNA、轉(zhuǎn)錄、翻譯等過程形成病毒顆粒。引物合成的固相合成原理都一樣，采用的機器也基本相同，合成主要原料都是由可數(shù)的幾家跨國公司提供的，所有每個合成服務商遇到的問題也基本類似，沒有人可以超脫。

引物合成是一種多步驟的化學反應，合成也就是99%，副產(chǎn)品不可以避免。引物序列中插入突變往往是堿基重復，一般認為，偶連過程中，正在偶連的部分單體發(fā)生丟失DMT,導致單體又接了上去，故發(fā)生插入同一堿基的突變。至于缺失突變，一般認為是一般認為是帶帽(capping)反應不造成的，Caping反應主要是封閉數(shù)5′-羥基沒有參加反應單體。被封閉的引物，在下一輪偶連時將不能繼續(xù)參與合成。對于堿基置換的突變，產(chǎn)生的原因一般認為是堿基不能100%脫保護，即引物上可能含有殘留保護基團，引物的這些區(qū)域不能很好地與互補鏈配對，當擴增的產(chǎn)品被亞轉(zhuǎn)化到大腸中，可能被細菌中修復系統(tǒng)補上了非配對的堿基。置換突變通常發(fā)生在G 轉(zhuǎn)換成其它堿基。堿基G在一定條件下可以轉(zhuǎn)化為烯醇異構(gòu)體 （脫呤），2,6 diaminopurine , DNA和擴增過程中DNA聚合酶將2,6 diaminopurine看作堿基A，測序就會發(fā)現(xiàn)堿基G-A置換。脫呤現(xiàn)象在富含呤的引物中發(fā)生的頻率較高。lncRNA-Seq可一次性獲得樣本中全部的lncRNAs信息，對lncRNAs的類別、功能進行的深入分析，從而快速準確地獲得與特定生物學過程（例如發(fā)育、疾病等）相關lncRNA信息。脫呤的引物在引物后處理脫保護階段如果被降解，測序就會發(fā)現(xiàn)堿基G或A的缺失。

引物合成過程中，造成堿基插入，缺失，置換突變的因素客觀存在，有不少降低發(fā)生的頻率建議和措施，但是這些措施還停留在實驗室階段，還沒有能夠應用到規(guī)?；a(chǎn)中。