大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)

方法：分離大鼠主動(dòng)脈,直接貼壁于培養(yǎng)皿中,熒光倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài),免yi組化Ⅷ因子相關(guān)抗原染色鑒定細(xì)胞.結(jié)果:約24小時(shí)組織塊邊緣有游離的 新生細(xì)胞長(zhǎng)出,7天即融合成片.消化傳代后細(xì)胞呈短梭形或三角形,單層生長(zhǎng),鋪路石狀,Ⅷ因子表達(dá)陽(yáng)性,呈指數(shù)增殖.凍存后復(fù)蘇細(xì)胞活性均超過90%.結(jié) 論:用貼壁法成功建立了大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞體外培養(yǎng)方法,凍存細(xì)胞存活率高,為體外研究提供了穩(wěn)定的模型.

3D細(xì)胞培養(yǎng)

3D多細(xì)胞腫liu球是在體外應(yīng)用組織培養(yǎng)方法使腫liu細(xì)胞以多細(xì)胞集聚體的形式生長(zhǎng)成為具有三維結(jié)構(gòu)的球體。與傳統(tǒng)的2D貼壁細(xì)胞培養(yǎng)模型相比，3D多細(xì)胞腫liu球可以通過模擬三維細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)、細(xì)胞與基質(zhì)、細(xì)胞與細(xì)胞之間的相互作用，從而更加貼近腫liu組織中相應(yīng)的病理生理特征。2%戊er醛，37℃，4h，棄掉板中的處理液，用PBS洗滌3次，每次3min。因此, 3D多細(xì)胞腫liu球培養(yǎng)模型已經(jīng)逐漸應(yīng)用于gan細(xì)胞培養(yǎng)和分化、ai癥研究、yao物和毒性篩選及組織工程等特定應(yīng)用中。雖然3D多細(xì)胞腫liu球模型具有更顯著的實(shí)體腫liu生理相關(guān)性，但是與2D貼壁細(xì)胞培養(yǎng)模型相比，獲得大量相對(duì)統(tǒng)一的3D多細(xì)胞腫liu球模型需要-系列的培養(yǎng)過程和表征手段。

三、自噬過程進(jìn)行觀察和檢測(cè)

1、觀察自噬體的形成

由于自噬體屬于亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，普通光鏡下看不到，因此，直接觀察自噬體需在透射電鏡下。Phagophore的特征為:新月狀或杯狀，雙層或多層膜,有包繞胞漿成分的趨勢(shì)。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)介紹——慢病毒建立穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系慢病毒包裝：公司使用3質(zhì)粒慢病毒包裝系統(tǒng)，慢病毒系統(tǒng)使用pLKO。自噬體(AV1 )的特征為:雙層或多層膜的液泡狀結(jié)構(gòu)，內(nèi)含胞漿成分，如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體等。自噬溶酶體(AV2 )的特征為:單層膜，胞漿成分己降解。( autophagic vacuolo AV )

2、在熒光顯微鏡下采用GFP-LC3融合蛋 白來(lái)示蹤自噬形成由于電鏡耗時(shí)長(zhǎng)，不利于監(jiān)測(cè)(Monitoring) 自噬形成，人們利用LC3在自噬形成過程中發(fā)生聚集的現(xiàn)象開發(fā)出了此技術(shù)。破損時(shí)凋亡細(xì)胞表面的磷脂腺絲氨酸(PS)可以從細(xì)胞內(nèi)膜翻轉(zhuǎn)至細(xì)胞的外膜。無(wú)自噬時(shí)，GFP-LC3融合蛋 白彌散在胞漿中;自噬形成時(shí)，GFP-LC3融合蛋白轉(zhuǎn) 位至自噬體膜，在熒光顯微鏡下形成多個(gè)明亮的綠色熒光斑點(diǎn)，一個(gè)斑點(diǎn)相當(dāng)于一個(gè)自噬體，可以通過計(jì)數(shù)來(lái)評(píng)價(jià)自噬活性的高低。

3、利用Western Blot檢測(cè)LC3-II/比值的變化以評(píng)價(jià)自噬形成自噬形成時(shí)，胞漿型LC3 (即 LC3-I)會(huì)酶解掉一小段多肽，轉(zhuǎn)變?yōu)?自噬體)膜型(即LC3-ID，因此，LC3-II/比值 的大小可估計(jì)自噬水平的高低。(3)從中間剪斷股骨和脛骨，用2ml無(wú)菌注she器吸取DMEM/F12溶液沖出gu髓細(xì)胞多次，再用針頭吹打，吸管吸入離心管內(nèi)，1000r/min離心5min，棄上清，用PBS重懸細(xì)胞。(注意: LC3對(duì)LC3-II有更高的親和力，會(huì)造成假陽(yáng)性。方法2和3需結(jié)合使用，同時(shí)需考慮溶酶體活性的影響。)

4、MDC (Monodansylcadaverine ，單丹磺酰尸胺)染色:包括自噬體，所有酸性液泡都被染色，故屬于非特異性的。

5、CellTrackerTM Green染色:主要用于雙染色，但其能染所有的液泡，故也屬于非特異性的。

細(xì)胞分化

細(xì)胞分化是指同一來(lái)源的細(xì)胞逐漸產(chǎn)生出形態(tài)結(jié)構(gòu)、功能特征各不相同的細(xì)胞類群的過程，其結(jié)果是在空間上細(xì)胞產(chǎn)生差異，在時(shí)間上同一細(xì)胞與其從前的狀態(tài)有所不同。小鼠精原gan細(xì)胞分離富集和培養(yǎng)成年小鼠gao丸中約有108個(gè)細(xì)胞,其中約有2×104個(gè)是精原gan細(xì)胞,僅占gao丸生精上皮細(xì)胞總數(shù)的0。細(xì)胞分化的本質(zhì)是基因組在時(shí)間和空間上的選擇性表達(dá)，通過不同基因表達(dá)的開啟或關(guān)閉，終產(chǎn)生標(biāo)志性蛋白質(zhì)。細(xì)胞誘導(dǎo)是指將一群不同類型或者形態(tài)結(jié)構(gòu)、功能特征存在差異的細(xì)胞通過生物學(xué)、物理學(xué)等手段，將之轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂邢嗨?相同形態(tài)結(jié)構(gòu)、功能特征的細(xì)胞群體的過程。