低溫生物菌種怎么保藏

菌種保藏(culture preservation，culture collection)是指保持微生物菌株的生活力和遺傳性狀的技術(shù)?；蚪?jīng)人工選育得到的變異型純種，使其存活、不丟失、不污染雜菌、不發(fā)生或少發(fā)生變異，保持菌種原有的各種特征和生理活性?；驹硎鞘刮⑸锏纳顒?dòng)處于休眠狀態(tài)，也就是使微生物的新陳代謝作用限制在低范圍內(nèi)。干燥、低溫和隔絕空氣是保證獲得這種狀態(tài)的主要措施。有針對(duì)性地創(chuàng)造干燥、低溫和隔絕空氣的外界條件，就是微生物菌種保藏的基本技術(shù)。常用的方法有凍干保藏法、深低溫保藏法、液氮保藏法、礦油封藏法、固體曲保藏法、砂土管保藏法、瓊脂穿刺保藏法等。日常工作中，常選用4℃冰箱進(jìn)行短時(shí)間的菌種保藏

                                                       低溫生物菌種貯存的方式

1.冷凍真空干燥法。將已培養(yǎng)、生長(zhǎng)豐富的菌體或孢子懸浮于滅菌的、卵白、脫脂奶制成菌懸液，將懸液以無(wú)菌操作分裝于滅菌的玻璃安瓿瓶中，每管約0.3-0.5毫升，然后用耐壓橡皮管與冷凍干燥裝置連接，安瓿瓶放在冷凍槽中于-30℃至-40℃迅速冷凍，并在冷凍狀態(tài)下抽空干燥，并在真空狀態(tài)下熔封安瓿，在-20℃保存，一般可保存十年以上，但成本較高。

     2.液氮超低溫保藏法。首先將要保藏的菌種制成菌懸液備用；其次，準(zhǔn)備安瓿瓶，每瓶加入0.8毫升冷凍保護(hù)劑10%（體積比）甘油蒸餾水溶液，塞棉塞滅菌（1公斤/平方厘米，5分鐘）。無(wú)菌檢查后，接入要保藏的菌種，火焰熔封瓶口，檢查是否漏氣，將封好口的安瓿瓶放在凍結(jié)器內(nèi)，以每分鐘下降1℃的速度緩慢降溫，使保藏品逐步均勻地凍結(jié)，直至-35℃，以后凍結(jié)速度就不需控制，安瓿凍結(jié)后立即放入液氮罐內(nèi)，在-150至-196℃保藏，該法只有少數(shù)科研院所使用。

低溫生物菌種的寄主分離法

即從生長(zhǎng)有某種真菌的寄主體上(如茯苓、木耳木段)取下木片，進(jìn)行分離的方法。如木耳制種時(shí)，可選朵大、出耳多、質(zhì)厚的耳棒(即長(zhǎng)有木耳的木段)。采集后，削去耳根下的樹(shù)皮，將其橫斷面鋸成1 厘米厚的木片，在無(wú)菌條件下，切去無(wú)耳菌絲部分，留下有耳菌絲部分，浸入0 . 1 %水中1 分鐘，取出再用無(wú)菌水沖去木片上的液。然后，用解剖刀將木片切成0 . 5 厘米的小塊，放入斜面培養(yǎng)基內(nèi)，置24 ~26 ℃下培養(yǎng)，及時(shí)淘汰雜菌，選取純菌絲進(jìn)行移植培養(yǎng)，即得菌種。

低溫生物菌種的冷凍干燥保藏法

(1)準(zhǔn)備安瓿管用于冷凍干燥菌種保藏的安瓿管宜采用中性玻璃制造，形狀可用長(zhǎng)頸球形底的，亦稱(chēng)淚滴型安瓿管(圖Ⅶ-15)，大小要求外徑6-7.5mm，長(zhǎng)105mm，球部直徑9-11mm，壁厚0.6-1.2mm。也可用沒(méi)有球部的管狀安瓿管。塞好棉塞，1.05kg/cm2>，121.3℃滅菌30分鐘，備用。

(2)準(zhǔn)備菌種，用冷凍干燥法保藏的菌種，其保藏期可達(dá)數(shù)年至十?dāng)?shù)年，為了在許多年后不出差錯(cuò)，故所用菌種要特別注意其純度，即不能有雜菌污染，然后在適培養(yǎng)基中用適溫度培養(yǎng)，使培養(yǎng)出良好的培養(yǎng)物。細(xì)菌和酵母的菌齡要求超過(guò)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，若用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌種進(jìn)行保藏，其存活率反而降低。一般，細(xì)菌要求24-48小時(shí)的培養(yǎng)物;酵母需培養(yǎng)3天;形成孢子的微生物則宜保存孢子;線菌與絲狀真菌則培養(yǎng)7-10天。

(3)制備菌懸液與分裝以細(xì)菌斜面為例，用脫脂牛乳2ml左右加入斜面試管中，制成濃菌液，每支安瓿管分裝0.2ml。

(4)冷凍冷凍干燥器有成套的裝置出售，價(jià)值昂貴，此處介紹的是簡(jiǎn)易方法與裝置，可達(dá)到同樣的目的。

將分裝好的安瓿管放低溫冰箱中冷凍，無(wú)低溫冰箱可用冷凍劑如干冰(固體CO2>)酒精的液或干冰酮液，溫度可達(dá)-70℃。將安瓿管插入冷凍劑，只需冷凍4-5分鐘，即可使懸液結(jié)冰。