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屠宰場(chǎng)核酸提取純化服務(wù)放心可靠

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發(fā)布時(shí)間:2020-07-26 05:28  






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熒光定量PCR技術(shù)產(chǎn)生并成熟于上世紀(jì)90年代,由于該技術(shù)實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍,能夠?qū)CR反應(yīng)的全過程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控,并且自動(dòng)化程度高,所以該技術(shù)從產(chǎn)生到現(xiàn)在短短的十幾年時(shí)間,在科研及檢驗(yàn)領(lǐng)域獲得了廣泛的應(yīng)用,成為分子生物學(xué)領(lǐng)域不可或缺的一項(xiàng)重要技術(shù)。屠宰廠(場(chǎng))生產(chǎn)設(shè)施設(shè)備和環(huán)境一旦被污染,病毒更易長(zhǎng)期存活,更易在生豬和豬肉產(chǎn)品中循環(huán)擴(kuò)增,成為病毒的“儲(chǔ)存器”“擴(kuò)增器”。熒光定量PCR技術(shù)是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),利用熒光信號(hào)隨著PCR反應(yīng)的積累來實(shí)時(shí)監(jiān)控PCR反應(yīng)的進(jìn)程,并通過分析軟件對(duì)PCR的反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)分析的技術(shù)。系統(tǒng)組成:定量PCR儀、電腦、分析軟件、試劑及耗材。

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進(jìn)行熒光定量PCR體系的配制時(shí)i好在冰上進(jìn)行,操作環(huán)境不用非得在超凈臺(tái)中進(jìn)行,環(huán)境安靜整潔都可以。廣州勱博--冷凍食品加工企業(yè)/公司/廠熒光定量PCR相對(duì)定量可以對(duì)每個(gè)樣本中模版的其實(shí)水平之間的差異進(jìn)行精i確比較,沒必要知道模版的確切拷貝數(shù),并且樣本模板中的相對(duì)水平不用使用標(biāo)準(zhǔn)曲線就可以確定。因?yàn)槊恳粋€(gè)梯度要做三個(gè)重復(fù),因此先在1ml的無菌離心管中配制好后再分裝入96孔板中。實(shí)驗(yàn)中我使用過熒光定量八聯(lián)管和96孔板,個(gè)人推薦96孔板。因?yàn)榘寺?lián)管你需要蓋上蓋子,而且蓋子比較的難按下去,稍不慎就把八聯(lián)管弄斷或者液體撒出來。有的時(shí)候一下忘記了是從哪邊開始的。96孔板比較方便,加完樣品后只需附上一層膜,用它自帶的板子撫平即可。上機(jī)器前i好離心一下,讓貼在管壁上的液體流下來同時(shí)也消掉氣泡。


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一般而言,熒光擴(kuò)增曲線可以分成三個(gè)階段:熒光背景信號(hào)階段,熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺(tái)期。夏秋季節(jié)消毒沒什么問題,但到了冬天,他們?nèi)匀辉谏嵬庋粝?,這樣的效果是很差的。在熒光背景信號(hào)階段,擴(kuò)增的熒光信號(hào)被熒光背景信號(hào)所掩蓋, 無法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺(tái)期,擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級(jí)的增加,PCR 的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系,根據(jù)終的 PCR 產(chǎn)物量也不能計(jì)算出起始 DNA 拷貝數(shù)。只有在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段, PCR產(chǎn)物量的對(duì)數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系,我們可以選擇在這個(gè)階段進(jìn)行定量分析。為了定量和比較的方便,在實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)中引入了兩個(gè)非常重要的概念:熒光閾值和 CT值.

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什么是熒光定量PCR?常規(guī)PCR中,擴(kuò)增產(chǎn)物(擴(kuò)增子)是通過終點(diǎn)法來分析檢測(cè),即PCR反應(yīng)結(jié)束后,DNA通過瓊脂糖凝膠電泳,然后進(jìn)行成像分析。另外,熒光定量PCR的結(jié)果無需通過瓊脂糖凝膠電泳來評(píng)估,大大節(jié)省實(shí)驗(yàn)時(shí)間,提高實(shí)驗(yàn)效率。而熒光定量PCR可以在反應(yīng)進(jìn)行過程中進(jìn)行累積擴(kuò)增產(chǎn)物的分析和檢測(cè),即“實(shí)時(shí)”。在反應(yīng)體系中加入熒光分子,通過熒光信號(hào)的按比例增加來反應(yīng)DNA量的增加,使PCR產(chǎn)物的實(shí)時(shí)檢測(cè)成為可能。滿足實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡臒晒饣瘜W(xué)物質(zhì)包括DNA結(jié)合染料和熒光標(biāo)記的序列特異引物或探針;專門的熱循環(huán)儀配備熒光檢測(cè)模塊,用于監(jiān)測(cè)擴(kuò)增時(shí)的熒光,檢測(cè)到的熒光信號(hào)反映了每個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物的量。


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定量PCR已經(jīng)從基于凝膠的低通量分析發(fā)展到高通量的熒光分析技術(shù),即實(shí)時(shí)定量PCR。此外,用real-timeQ-PCR來研究mRNA時(shí),受到不同RNA樣本存在不同的逆轉(zhuǎn)錄(RT)效率的限制。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)于1996年由美國(guó)Applied Biosystems公司推出,由于該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍,而且與常規(guī)PCR相比,它具有特異性更強(qiáng)、有效解決PCR污染問題、自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)。實(shí)時(shí)定量PCR (real-time quantitative PCR)是指在PCR指數(shù)擴(kuò)增期間通過連續(xù)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)強(qiáng)弱的變化來即時(shí)測(cè)定特異性產(chǎn)物的量,并據(jù)此推斷目的基因的初始量,不需要取出PCR產(chǎn)物進(jìn)行分離。

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PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針,該探針為一寡核苷酸,兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。PCR技術(shù)是目前最i簡(jiǎn)單、快速的分子學(xué)檢測(cè)方法,但該方法的敏感性有限,因此以PCR為基礎(chǔ)的更新方法應(yīng)運(yùn)而生。探針完整時(shí),報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收;PCR擴(kuò)增時(shí),Taq酶的5’-3’外切酶活性將探針酶切降解,使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離,從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào),即每擴(kuò)增一條DNA鏈,就有一個(gè)熒光分子形成,實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步.


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