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發(fā)布時(shí)間:2020-10-31 09:26  






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在real-time Q-PCR技術(shù)中,無論是相對(duì)定量還是標(biāo)準(zhǔn)曲線定量方法仍存在一些PCR定量方法均有的問題有待解決。在標(biāo)準(zhǔn)曲線定量中,標(biāo)準(zhǔn)品的制備是一個(gè)必不可少的過程。目前由于無一統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn),各個(gè)實(shí)驗(yàn)室所用的生成標(biāo)準(zhǔn)曲線的樣品各不相同,致使實(shí)驗(yàn)結(jié)果缺乏可比性。廣州勱博--屠宰場熒光定量PCR擴(kuò)增序列特異性檢測方法是在PCR反應(yīng)中利用標(biāo)記熒光染料的基因特異寡核苷酸探針來檢測產(chǎn)物,它又可分為直接法和間接法。此外,用real-time Q-PCR來研究mRNA時(shí),受到不同RNA樣本存在不同的逆轉(zhuǎn)錄(RT)效率的限制。在相對(duì)定量中,其前提是假設(shè)內(nèi)源控制物不受實(shí)驗(yàn)條件的影響的,合理地選擇合適的不受實(shí)驗(yàn)條件影響的內(nèi)源控制物也是實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠與否的關(guān)鍵。

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與傳統(tǒng)的PCR技術(shù)相比,Real-time Q-PCR的不足之處是:(1)由于運(yùn)用了封閉的檢測,減少了擴(kuò)增后電泳的檢測步驟,因此也就不能監(jiān)測擴(kuò)增產(chǎn)物的大?。粡V州勱博--冷凍食品加工企業(yè)/公司/廠核酸提取純化QF-PCR技術(shù)在國外已有較廣泛的應(yīng)用,但目前尚未在國內(nèi)產(chǎn)前診斷臨床中普遍開展。(2)因?yàn)闊晒馑胤N類以及檢測光源的局限性,從而相對(duì)地限制了real-time Q-PCR的復(fù)合式(multiplex)檢測的應(yīng)用能力;(3)目前real-time Q-PCR實(shí)驗(yàn)成本比較高,從而也限制了其廣泛的應(yīng)用。


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熒光定量PCR技術(shù)產(chǎn)生并成熟于上世紀(jì)90年代,由于該技術(shù)實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍,能夠?qū)CR反應(yīng)的全過程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控,并且自動(dòng)化程度高,所以該技術(shù)從產(chǎn)生到現(xiàn)在短短的十幾年時(shí)間,在科研及檢驗(yàn)領(lǐng)域獲得了廣泛的應(yīng)用,成為分子生物學(xué)領(lǐng)域不可或缺的一項(xiàng)重要技術(shù)。熒光定量PCR技術(shù)是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),利用熒光信號(hào)隨著PCR反應(yīng)的積累來實(shí)時(shí)監(jiān)控PCR反應(yīng)的進(jìn)程,并通過分析軟件對(duì)PCR的反應(yīng)進(jìn)行檢測分析的技術(shù)。其原理:隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行,PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計(jì),熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增加。系統(tǒng)組成:定量PCR儀、電腦、分析軟件、試劑及耗材。

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進(jìn)行熒光定量PCR體系的配制時(shí)i好在冰上進(jìn)行,操作環(huán)境不用非得在超凈臺(tái)中進(jìn)行,環(huán)境安靜整潔都可以。因?yàn)槊恳粋€(gè)梯度要做三個(gè)重復(fù),因此先在1ml的無菌離心管中配制好后再分裝入96孔板中。實(shí)驗(yàn)中我使用過熒光定量八聯(lián)管和96孔板,個(gè)人推薦96孔板。因?yàn)榘寺?lián)管你需要蓋上蓋子,而且蓋子比較的難按下去,稍不慎就把八聯(lián)管弄斷或者液體撒出來。二、應(yīng)急期間,比對(duì)符合要求的檢測試劑盒(試紙條)可使用至2019年6月30日。有的時(shí)候一下忘記了是從哪邊開始的。96孔板比較方便,加完樣品后只需附上一層膜,用它自帶的板子撫平即可。上機(jī)器前i好離心一下,讓貼在管壁上的液體流下來同時(shí)也消掉氣泡。


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一般而言,熒光擴(kuò)增曲線可以分成三個(gè)階段:熒光背景信號(hào)階段,熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺(tái)期。在熒光背景信號(hào)階段,擴(kuò)增的熒光信號(hào)被熒光背景信號(hào)所掩蓋, 無法判斷產(chǎn)物量的變化。因?yàn)椴≡w往往附著于其他物質(zhì)上面或中間,消毒i藥與病原接觸需要先滲透,而滲透則需要時(shí)間,有時(shí)時(shí)間會(huì)很長。而在平臺(tái)期,擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級(jí)的增加,PCR 的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系,根據(jù)終的 PCR 產(chǎn)物量也不能計(jì)算出起始 DNA 拷貝數(shù)。只有在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段, PCR產(chǎn)物量的對(duì)數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系,我們可以選擇在這個(gè)階段進(jìn)行定量分析。為了定量和比較的方便,在實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)中引入了兩個(gè)非常重要的概念:熒光閾值和 CT值.

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什么是熒光定量PCR?常規(guī)PCR中,擴(kuò)增產(chǎn)物(擴(kuò)增子)是通過終點(diǎn)法來分析檢測,即PCR反應(yīng)結(jié)束后,DNA通過瓊脂糖凝膠電泳,然后進(jìn)行成像分析。而熒光定量PCR可以在反應(yīng)進(jìn)行過程中進(jìn)行累積擴(kuò)增產(chǎn)物的分析和檢測,即“實(shí)時(shí)”。在反應(yīng)體系中加入熒光分子,通過熒光信號(hào)的按比例增加來反應(yīng)DNA量的增加,使PCR產(chǎn)物的實(shí)時(shí)檢測成為可能。熒光定量PCR技術(shù)是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),利用熒光信號(hào)隨著PCR反應(yīng)的積累來實(shí)時(shí)監(jiān)控PCR反應(yīng)的進(jìn)程,并通過分析軟件對(duì)PCR的反應(yīng)進(jìn)行檢測分析的技術(shù)。滿足實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡臒晒饣瘜W(xué)物質(zhì)包括DNA結(jié)合染料和熒光標(biāo)記的序列特異引物或探針;專門的熱循環(huán)儀配備熒光檢測模塊,用于監(jiān)測擴(kuò)增時(shí)的熒光,檢測到的熒光信號(hào)反映了每個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物的量。


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根據(jù)動(dòng)物防疫法及其配套規(guī)章規(guī)定,縣級(jí)動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)督機(jī)構(gòu)依法向屠宰場派駐(出)官i方獸醫(yī)實(shí)施屠宰檢疫。在不使用時(shí)蓋住接收坑,有效地控制害蟲,防止灰塵收集系統(tǒng)中的灰塵再循環(huán)回到飼料中,并管理好整個(gè)工廠的人員移動(dòng)。按照生豬屠宰檢疫規(guī)程和相關(guān)規(guī)定,屠宰檢疫內(nèi)容包括傳i染病和寄i生蟲病,檢疫流程包括生豬進(jìn)入屠宰廠(場、點(diǎn))監(jiān)督查驗(yàn)、檢疫申報(bào)、宰前檢查、同步檢疫、檢疫結(jié)果處理以及檢疫記錄等。在非洲防控期間,官i方獸醫(yī)監(jiān)督屠宰企業(yè)開展非洲自檢,對(duì)沒有開展自檢的屠宰企業(yè),對(duì)屠宰后的生豬產(chǎn)品一律不得出具動(dòng)物檢疫證明。

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實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time quantitativePCR)/QRT-PCR,是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光標(biāo)記物,利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR進(jìn)程,后通過擴(kuò)增曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。(2)此后熒光雙標(biāo)記探針的運(yùn)用使在一密閉的反應(yīng)管中能實(shí)時(shí)地監(jiān)測反應(yīng)全過程。一般用于mRNA轉(zhuǎn)錄水平的定量研究、不同樣本或基因組中DNA拷貝數(shù)的測定、基因芯片結(jié)果驗(yàn)證、藥i效分析等。金開瑞采用SYBR熒光染料法及TaqMan探針法進(jìn)行熒光定量PCR檢測,從引物設(shè)計(jì)到檢測一次性完成,提供2種常用的內(nèi)參引物及免費(fèi)的專業(yè)數(shù)據(jù)分析,每個(gè)樣品設(shè)置至少三個(gè)平行對(duì)照,保證結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。


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