陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照的體外GTPγS/ GDP蛋白質(zhì)上樣量

注意：體內(nèi)細(xì)胞刺激將激l活可用Arf 6的大約10％，而體外GTPγS蛋白負(fù)載將激l活A(yù)rf 6的將近90％。

1，將0.5 ml每種細(xì)胞提取物等分到兩個(gè)微量離心管中（或使用1 μg純化的Arf 6蛋白）。

2，向每個(gè)試管中加入20 μl 0.5 M EDTA（終濃度為20 mM）。

3，將5 μl 100 XGTPγS（至100 μM，終濃度）加到一個(gè)試管中（陽(yáng)性對(duì)照）。

4，在第二個(gè)試管中加入5 μl 100 X GDP（至1 mM，終濃度）（陰性對(duì)照）。

5，在攪拌下將試管在30°C孵育30分鐘。

6，通過將試管放在冰上并添加32.5 μl 1 M MgCl2（至60 mM，終濃度）來停止加載。

Arl3（類似Arf的3）是一種ADP-核糖基化因子（Arf）家族蛋白，在N端延伸方面不同于大多數(shù)Arf家族成員。 Arl3的核苷酸交換是快速的，并且與脂質(zhì)和去污劑無關(guān)。 與GDT / GTP結(jié)合后，Arl3與一系列效應(yīng)蛋白相互作用，并調(diào)節(jié)這些效應(yīng)蛋白的活性，例如人類視網(wǎng)l膜基因4（HRG4），cGMP磷酸二酯酶的δ亞基（PDEδ）和Arl2的結(jié)合物（BART）。 Arl3還以可調(diào)節(jié)的方式結(jié)合微管，以通過與色素性視網(wǎng)l膜炎2（RP2）相互作用來改變胞質(zhì)分裂的特定方面。 有人提出，RP2與Arl3協(xié)同作用，將光感受器中的細(xì)胞膜和細(xì)胞骨架連接為細(xì)胞的一部分

9.收集上清液并在冰上存儲(chǔ)樣品（約1-2 mg總蛋白）以進(jìn)行中間使用，或?qū)⑵淅鋬霾⒈４嬖?70°C下以備將來使用。

檢測(cè)原理

    武漢紐斯特生物技術(shù)有限公司的Cdc42活性檢測(cè)試劑盒主要是利用識(shí)別蛋白特異形態(tài)的Cdc42-GTP單克l隆抗l體特異性的去檢測(cè)細(xì)胞提取物或者體外的（樣品需要進(jìn)行GTPγS活化處理）活性Cdc42-GTP的水平。簡(jiǎn)言之，特異性識(shí)別Cdc42活化構(gòu)象的鼠單克l隆抗l體可以特異性結(jié)合細(xì)胞裂解液中的Cdc42-GTP活性蛋白，然后利用protein A/G將抗原抗l體的結(jié)合物吸附下來，再利用特異性識(shí)別Cdc42活化構(gòu)象的兔多克l隆抗l體進(jìn)行免l疫印跡分析進(jìn)行檢測(cè)。

電泳和轉(zhuǎn)膜

1. 取15ul樣品/孔上樣17%配體膠。

2. 按照制造商的說明進(jìn)行SDS-PAGE。

3. 按照制造商的說明將凝膠蛋白轉(zhuǎn)到PVDF或硝化纖l維素膜。

免l疫印跡反應(yīng)和檢測(cè)（所有步驟都是在室溫下進(jìn)行，并不斷攪拌）

1. 將PVDF膜浸入100%甲l醇15s，然后在室溫放置5 min晾干。

注意：如果使用的是硝化纖l維素膜，此步省略。

2. 封閉：用TBST緩沖液配制5%的脫脂牛奶或者3%BSA在室溫下孵育1H進(jìn)行封閉，并需要恒定振蕩。

3. 孵育一抗：用TBST緩沖液配制的5%脫脂牛奶或3%BSA稀釋特異性識(shí)別Cdc42活性構(gòu)象的兔多克l隆抗l體（稀釋比例為1:50-1:1000，主要根據(jù)樣品中含有的Cdc42蛋白的量），室溫下孵育1-2小時(shí)，或者4°C條件下過夜孵育。

4. 用TBST緩沖液洗滌膜三次/5min。

5. 孵育二抗：（例如羊抗兔IgG-HRP），用TBST緩沖液配制的5%脫脂牛奶或3%BSA按1:1000稀釋比例稀釋后使用，室溫下孵育1小時(shí)并恒定振蕩。

6. 用TBST緩沖液洗滌膜三次/5min。

7. 使用實(shí)驗(yàn)者所選擇的檢測(cè)方法進(jìn)行顯色如ECL顯色法。