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在PCR擴(kuò)增中，溶液中的模板變性后低溫退火時(shí)，引物與探針同時(shí)與模板結(jié)合。在引物的介導(dǎo)下，沿模板向前延伸至探針結(jié)合處，發(fā)生鏈的置換，Taq酶的5′-3′外切酶活性（此活性是雙鏈特異性的，游離的單鏈探針不受影響）將探針5′端連接的熒光基團(tuán)從探針上切割下來，游離于反應(yīng)體系中，從而脫離3′端熒光淬滅基團(tuán)的屏蔽，接受光刺激發(fā)出熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。如測(cè)定病i人樣本中病原體的含量、實(shí)驗(yàn)樣本中某一特定的mRNA的含量等。

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直接的方法指的是標(biāo)記熒光的探針與擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合后即直接產(chǎn)生熒光，分子信標(biāo)（molecular beacon）就屬于這一類，它本質(zhì)上是一種標(biāo)記熒光的發(fā)夾探針，當(dāng)探針分子呈發(fā)夾結(jié)構(gòu)時(shí)，結(jié)合在其兩端的熒光基團(tuán)距離上接近，使得產(chǎn)生能量轉(zhuǎn)移效應(yīng)，而不發(fā)生熒光。當(dāng)互補(bǔ)序列出現(xiàn)時(shí)，探針與DNA雜交，探針轉(zhuǎn)變成一個(gè)開放的結(jié)構(gòu)，呈線性，報(bào)告熒光基團(tuán)與淬滅熒光基團(tuán)彼此在空間上產(chǎn)生足夠的分離，熒光基團(tuán)脫離了淬滅基團(tuán)的影響，從而產(chǎn)生可被檢測(cè)到的熒光。PCR技術(shù)是目前最i簡(jiǎn)單、快速的分子學(xué)檢測(cè)方法，但該方法的敏感性有限，因此以PCR為基礎(chǔ)的更新方法應(yīng)運(yùn)而生。

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熒光定量PCR樣品RNA的抽提①取凍存已裂解的細(xì)胞，室溫放置5分鐘使其完全溶解。②兩相分離 每1ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2ml的氯i仿，蓋緊管蓋。廣州勱博--屠宰場(chǎng)核酸提取純化一般情況下，高溫消毒時(shí)，60℃就可以將多數(shù)病原殺滅，但汽i油噴燈溫度達(dá)幾百度，噴燈火焰一掃而過，也不會(huì)殺滅病原，因時(shí)間太短。手動(dòng)劇烈振蕩管體15秒后，15到30℃孵育2到3分鐘。4℃下12000rpm離心15分鐘。離心后混合液體將分為下層的紅色酚氯i仿相，中間層以及無色水相上層。RNA全部被分配于水相中。水相上層的體積大約是勻漿時(shí)加入的TRIZOL試劑的60%。

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近年來，分子遺傳學(xué)診斷技術(shù)發(fā)展迅速，熒光定量PCR（QF-PCR）技術(shù)、熒光原位雜交（FISH）技術(shù)、多重連接探針擴(kuò)增（MLPA）技術(shù)、實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)、染色體微陣列分析（CMA）技術(shù)、產(chǎn)前液相芯片（BoBs）技術(shù)、無創(chuàng)性產(chǎn)前基因檢測(cè)（NIPT）等已逐漸成熟，并開始向臨床轉(zhuǎn)化。其原理：隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計(jì)，熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增加。分子遺傳學(xué)診斷技術(shù)多以遺傳物質(zhì)DNA為檢測(cè)對(duì)象，不需要進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，為傳統(tǒng)的細(xì)胞染色體核型分析技術(shù)提供了有效的補(bǔ)充。

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非洲病毒的附著力到底有多強(qiáng)？直接接觸或者攜帶病毒的物品再次傳播的能力有多強(qiáng)？尚不清晰。目前已知非洲是高度接觸性傳播的急性、烈性i病毒，主要通過接觸或采食受非洲病毒污染的物品，以及通過昆蟲吸血而傳i染。相對(duì)定量分析以實(shí)時(shí)PCR方式執(zhí)行，在實(shí)時(shí)PCR分析過程中，PCR基因擴(kuò)增一直在監(jiān)控中，在PCR進(jìn)行期間進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，而不是在PCR結(jié)束時(shí)（終點(diǎn)PCR）才獲取數(shù)據(jù)。短距離可經(jīng)空氣傳播、污染的飼料、泔水、剩菜及肉屑、欄舍、車輛、器具和衣服等均可間接傳播本病。而且目前公認(rèn)ASFV對(duì)外界的抵抗力強(qiáng)，在自然條件下可以長(zhǎng)時(shí)間保持感i染性，可以在血液、糞便和各種組織中長(zhǎng)期保持感i染性。含有病毒的血液是該病發(fā)生傳播的重要因素。

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非洲（African Swine Fever，ASF）是由非洲病毒（African Swine Fever Virus，ASFV）引起的一種急性、烈性、高度接觸性傳i染病，致死率100%。研究表明，每個(gè)模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。自2018年8月寧省沈陽市發(fā)生第i一起非洲i疫情起，目前全國(guó)已有29個(gè)省115個(gè)地方發(fā)生非洲i疫情，已撲殺數(shù)百萬頭生豬，直接經(jīng)濟(jì)損失數(shù)百億元。目前全世界都沒有有效的非洲i疫i苗進(jìn)行預(yù)防，現(xiàn)在有效的防控方法仍然是對(duì)非洲病毒進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，對(duì)發(fā)生疫情的地方嚴(yán)防死守，對(duì)疫點(diǎn)地區(qū)生豬全部撲殺，進(jìn)行無害化處理，防止疫情的擴(kuò)散。