生物有機(jī)肥產(chǎn)品生產(chǎn)使用現(xiàn)狀

細(xì)菌類生產(chǎn)用除常見的芽孢外， 還出現(xiàn)了高地芽孢菌、 類干酪乳菌、 屎腸球菌、 鹽居固氮菌等新， 其中， 高地芽孢菌和鹽居固氮菌普遍存在于土壤環(huán)境中， 未見致病性報(bào)道， 屬風(fēng)險(xiǎn)一級(jí)； 類干酪乳菌又名為副干酪乳菌， 雖為風(fēng)險(xiǎn)一級(jí) ， 但有從動(dòng)物受傷部位分離到該菌的報(bào)道；屎腸球菌屬于乳酸菌類，屬風(fēng)險(xiǎn)二級(jí)， 建議謹(jǐn)慎使用。伯克霍爾德氏菌是一些具有生物防治、 促進(jìn)植物生長和生物修復(fù)等功能的細(xì)菌， 但同時(shí)也是可以引起鼻疽、 類鼻疽病的致病菌， 因此真菌伯克霍爾德氏菌屬于風(fēng)險(xiǎn)三級(jí)， 需做致病性試驗(yàn)， 建議慎用或不用。真菌類生產(chǎn)用菌株主要為絲狀真菌和酵母菌。哈茨木霉、 米曲霉、 淡紫紫孢菌、 長枝木霉、 綠色木霉、 棘孢木霉、 黑曲霉、 粉紅螺旋聚孢霉、 金龜子綠僵菌等屬于生物安全風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)二級(jí)， 需按照NY/T 1109－2017 《微生物肥料生物安全通用技術(shù)準(zhǔn)則》 進(jìn)行毒理學(xué)測(cè)試。酵母菌主要以釀酒酵母為主， 還有少量東方伊薩酵母、杰丁塞伯林德納氏酵母 （原產(chǎn)朊假絲酵母、 杰丁畢赤酵母）、 膜醭畢赤酵母、 解脂耶羅威亞酵母等， 屬于生物安全風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)一級(jí)， 可免做毒理學(xué)試驗(yàn)。

                                                          低溫生物的制備是什么？

將培養(yǎng)成熟的斜面孢子制成懸浮液，接種到扁瓶固體培養(yǎng)基上，于25～28℃培養(yǎng)14天。將成熟的扁瓶孢子于真空中抽干，使水分降至10%以下，并放入 4℃冰箱中備用。一次制得的孢子瓶可在生產(chǎn)上延續(xù)使用半年左右。放線孢子的培養(yǎng)基大多是采用麩皮或豌豆浸出液、牛肉膏及無機(jī)鹽與瓊脂制成的。將斜面孢子接入擴(kuò)大的扁瓶孢子培養(yǎng)基中,于28～37℃培養(yǎng)5～14天。所獲得的大量孢子可直接作為種子罐 (6)的種子。如果有些生產(chǎn)不產(chǎn)孢子，如赤霉產(chǎn)生菌或產(chǎn)孢子不多的,則可采用搖瓶（5）液體培養(yǎng)制得菌絲體，作種子罐的種子。種子罐的目的是使接入有限的孢子或菌絲體迅速發(fā)芽、生長、繁殖成大量菌體。其中的培養(yǎng)基組分應(yīng)是易于被菌體利用的碳源（如葡萄糖）和氮源（如玉米漿等）,及無機(jī)鹽(如磷酸鹽)等。作為發(fā)酵罐(7)的種子應(yīng)是生命力旺盛、染色深、菌絲粗壯,無雜菌及異常菌體。接種量一般在10%～20%。

                                                       低溫生物貯存的方式

1.冷凍真空干燥法。將已培養(yǎng)、生長豐富的菌體或孢子懸浮于滅菌的、卵白、脫脂奶制成菌懸液，將懸液以無菌操作分裝于滅菌的玻璃安瓿瓶中，每管約0.3-0.5毫升，然后用耐壓橡皮管與冷凍干燥裝置連接，安瓿瓶放在冷凍槽中于-30℃至-40℃迅速冷凍，并在冷凍狀態(tài)下抽空干燥，并在真空狀態(tài)下熔封安瓿，在-20℃保存，一般可保存十年以上，但成本較高。

     2.液氮超低溫保藏法。首先將要保藏的制成菌懸液備用；其次，準(zhǔn)備安瓿瓶，每瓶加入0.8毫升冷凍保護(hù)劑10%（體積比）甘油蒸餾水溶液，塞棉塞滅菌（1公斤/平方厘米，5分鐘）。無菌檢查后，接入要保藏的，火焰熔封瓶口，檢查是否漏氣，將封好口的安瓿瓶放在凍結(jié)器內(nèi)，以每分鐘下降1℃的速度緩慢降溫，使保藏品逐步均勻地凍結(jié)，直至-35℃，以后凍結(jié)速度就不需控制，安瓿凍結(jié)后立即放入液氮罐內(nèi)，在-150至-196℃保藏，該法只有少數(shù)科研院所使用。

低溫生物菌種純化方法

1、傾注平板法

首先把微生物懸液通過一系列稀釋，取一定量的稀釋液與熔化好的保持在40~50°左右的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基充分混合，然后把這混合液傾注到無菌的培養(yǎng)皿中，待凝固之后，把這平板倒置在恒箱中培養(yǎng)。單一細(xì)胞經(jīng)過多次增殖后形成一個(gè)菌落，取單個(gè)菌落制成懸液，重復(fù)上述步驟數(shù)次，便可得到純培養(yǎng)物 2、涂布平板法

首先把微生物懸液通過適當(dāng)?shù)南♂專∫欢康南♂屢悍旁跓o菌的已經(jīng)凝固的營養(yǎng)瓊脂平板上，然后用無菌的玻璃刀把稀釋液均勻地涂布在培養(yǎng)基表面上，經(jīng)恒溫培養(yǎng)便可以得到單個(gè)菌落。3、平板劃線法

簡(jiǎn)單的分離微生物的方法是平板劃線法。用無菌的接種環(huán)取培養(yǎng)物少許在平板上進(jìn)行劃線。劃線的方法很多，常見的比較容易出現(xiàn)單個(gè)菌落的劃線方法有斜線法、曲線法、方格法、四格法等。當(dāng)接種環(huán)在培養(yǎng)基表面上往后移動(dòng)時(shí)，接種環(huán)上的菌液逐漸稀釋，然后在所劃的線上分散著單個(gè)細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)，每一個(gè)細(xì)胞長成一個(gè)菌落。

2、富集培養(yǎng)法

富集培養(yǎng)法的方法和原理非常簡(jiǎn)單。我們可以創(chuàng)造一些條件只讓所需的微生物生長，在這些條件下，所需要的微生物能有效地與其他微生物進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)，在生長能力方面遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過其他微生物。所創(chuàng)造的條件包括選擇合適的碳源、能源、溫度、光、pH、滲透壓和氫受體等。在相同的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下，經(jīng)過多次重復(fù)移種，然后富集的菌株很容易在固體培養(yǎng)基上長出單菌落。如果要分離一些專性寄生菌，就必須把樣品接種到相應(yīng)敏感宿主細(xì)胞群體中，使其大量生長。通過多次重復(fù)移種便可以得到純的寄生菌。