親和柱的測定原理

親和柱，吸附力高柱容量大，適合于和HPLC、LC-MS及DON酶免分析試劑盒結(jié)合使用，定量檢測DON。適用于谷物、飼料等樣本中的DON凈化處理，提高了樣品的純度，純化后的提取液可用不同的分析方法測定。

測定的基礎(chǔ)是抗原反應(yīng)，抗嘔吐毒素(DON)的連接在柱內(nèi)凝膠介質(zhì)上，樣品中的DON經(jīng)過提取、過濾、稀釋，然后將樣品提取液緩慢通過DON親和柱，在親和柱內(nèi)，DON與結(jié)合，洗滌液通過親和柱除去未被結(jié)合的雜質(zhì)。之后洗脫DON，然后進(jìn)行相關(guān)分析。

親和柱親和層析過程中的注意事項(xiàng)

1、上樣

親和層析純化生物大分子通常采用柱層析的方法。親和層析柱一般很短，通常10cm左右。上樣時應(yīng)注意選擇適當(dāng)?shù)臈l件，包括上樣流速、緩沖液種類、pH、離子強(qiáng)度、溫度等，以使待分離的物質(zhì)能夠充分結(jié)合在親和吸附劑上。

2、洗脫

親和層析的另一個重要的步驟就是要選擇合適的條件使待分離物質(zhì)與配體分開而被洗脫出來。親和層析的洗脫方法可以分為兩種：特異性洗脫和非特異性洗脫。

親和柱——親和層析的分離原理

生物體中許多大分子化合物具有與其結(jié)構(gòu)相對應(yīng)的專一分子可逆結(jié)合的特性，如抗原與抗體，酶與底物或抑制，與受體等，這種結(jié)合往往是專一的而且是可逆的，生物分子間的這種結(jié)合力稱為親和力，親和層析的分離原理簡單地說就是通過將具有親和力的兩個分子中的一個固定在不溶性的基質(zhì)（也稱載體）上，利用分子間親和力的特異性和可逆性，對另一個分子進(jìn)行分離純化。被固定在基質(zhì)上的分子稱為配體，配體與基質(zhì)共價結(jié)合，構(gòu)成親和層析的固定相，稱為親和吸附劑，蛋白質(zhì)的生物特異性可以幫助選擇特異性的配體，一般是目的蛋白質(zhì)與配體結(jié)合而不吸附雜質(zhì)。蛋白質(zhì)吸附后再利用洗脫液的快速變換和加入競爭劑的方法進(jìn)行洗脫。

親和柱——親和層析的應(yīng)用

抗原和利用抗原、之間高特異的親和力而進(jìn)行分離的方法又稱為親和層析。例如將抗原結(jié)合于親和層析基質(zhì)上，就可以從中分離其對應(yīng)的。在蛋白質(zhì)工程菌發(fā)酵液中所需蛋白質(zhì)的濃度通常較低，用離子交換、凝膠過濾等方法都難于進(jìn)行分離，而親和層析則是一種非常有效的方法。將所需蛋白質(zhì)作為抗原，經(jīng)動物后制備，將與適當(dāng)基質(zhì)偶聯(lián)形成親和吸附劑，就可以對發(fā)酵液中的所需蛋白質(zhì)進(jìn)行分離純化?？乖㈤g親和力一般比較強(qiáng)，其解離常數(shù)為108－10?12M，所以洗脫時是比較困難的，通常需要較強(qiáng)烈的洗脫條件。可以采取適當(dāng)?shù)姆椒ㄈ绺淖兛乖?、種類或使用類似物等來降低二者的親和力，以便于洗脫。

另外金黃色球菌蛋白A（ProteinA）能夠與球蛋白G（IgG）結(jié)合，可以用于分離各種IgG。