ELISA試劑盒的操作方法——雙夾心法

1.包被：用0.05MPH9.牰碳酸鹽包被緩沖液將稀釋至蛋白質(zhì)含量為1～10μg/ml。在每個(gè)聚乙烯板的反應(yīng)孔中加0.1ml，4℃ 過夜。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鐘。（簡稱洗滌，下同）。

2.　加樣：加一定稀釋的待檢樣品0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中，置37℃ 孵育1小時(shí)。然后洗滌。（同時(shí)做空白孔，陰性對(duì)照孔及陽性對(duì)照孔）。

3.　加酶標(biāo)：于各反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)（經(jīng)滴定后的稀釋度）0.1ml。37℃ 孵育0.5～1小時(shí)，洗滌。

4.　加底物液顯色：于各反應(yīng)孔中加入臨時(shí)配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃ 10～30分鐘。

5.　終止反應(yīng)：于各反應(yīng)孔中加入2M硫酸0.05ml。

6.　結(jié)果判定：可于白色背景上，直接用肉眼觀察結(jié)果：反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深，陽性程度越強(qiáng)，陰性反應(yīng)為無色或極淺，依據(jù)所呈顏色的深淺，以“ ”、“-”號(hào)表示。也可測(cè)OD值：在ELISA檢測(cè)儀上，于450nm（若以ABTS顯色，則410nm）處，以空白對(duì)照孔調(diào)零后測(cè)各孔OD值，若大于規(guī)定的陰性對(duì)照OD值的2.1倍，即為陽性。

ELISA試劑盒的應(yīng)用領(lǐng)域

ELISA法是診斷中的一項(xiàng)新技術(shù)，現(xiàn)已成功地應(yīng)用于多種病原微生物所引起的病種等方面的診斷。也已應(yīng)用于大分子抗原和小分子抗原的定量測(cè)定，根據(jù)已經(jīng)使用的結(jié)果，認(rèn)為ELISA法具有靈敏、特異、簡單、快速、穩(wěn)定及易于自動(dòng)化操作等特點(diǎn)。不僅適用于臨床標(biāo)本的檢查，而且由于一天之內(nèi)可以檢查幾百甚至上千份標(biāo)本,因此，也適合于流行病學(xué)調(diào)查。本法不僅可以用來測(cè)定，而且也可用于測(cè)定體液中的循環(huán)抗原，所以也是一種早期診斷的良好方法。因此ELISA法在生物醫(yī)學(xué)各領(lǐng)域的應(yīng)用范圍日益擴(kuò)大，可概括四個(gè)方面：

1、酶染色各種細(xì)胞內(nèi)成份的定位。

2、研究抗酶的合成。

3、顯現(xiàn)微量的沉淀反應(yīng)。

4、定量檢測(cè)體液中抗原或成份。

ELISA試劑盒——會(huì)出現(xiàn)的問題及解決辦法

吸光值均偏高(或線性不夠陡)。

a.原因：室溫太高(>25℃)。

解決辦法： 若無法降低室內(nèi)溫度，請(qǐng)適當(dāng)縮短步驟4的溫育時(shí)間。

b.原因：底物溶液受到污染。

解決辦法： 若發(fā)現(xiàn)底物溶液已呈現(xiàn)淡藍(lán)色，請(qǐng)不要再使用。

c.原因：反應(yīng)時(shí)間超過太久。

解決辦法：請(qǐng)控制反應(yīng)時(shí)間。

d.原因：酶標(biāo)記物污染了盒內(nèi)其它試劑。

解決辦法：使用過的吸頭應(yīng)立即丟棄，可避免試劑間相互污染，凡是試劑(特別是酶標(biāo)記物與底物溶液)接觸過的容器應(yīng)立即清洗干凈。(先以漂白水浸泡，再以清水沖洗干凈，可確保無殘留)

ELISA試劑盒主要實(shí)驗(yàn)原理

·包被：抗原或者能以物理性吸附于固相載體表面，原因是蛋白質(zhì)和聚乙烯表面間的疏水性部分相互吸附，吸附之后能保持抗原反應(yīng)等活性；

·標(biāo)記：抗原或者可通過共價(jià)鍵與酶連接成酶結(jié)合物，而此種酶結(jié)合物仍能保持其活性和酶的催化特點(diǎn)；

·顯色：酶結(jié)合物與相應(yīng)包被在固相載體的抗原或者結(jié)合后，也被固定在固相載體上，加入酶的底物之后可出現(xiàn)顯色反應(yīng)，根據(jù)反應(yīng)的顏色深淺可計(jì)算抗原或者的相對(duì)含量。