本試劑盒利用競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免l疫分析方法來(lái)測(cè)定細(xì)胞提取物或體外腺苷酸環(huán)化酶實(shí)驗(yàn)中的cAMP的水平。簡(jiǎn)而言之，將羊抗鼠多克l隆抗l體包被在酶標(biāo)板上，細(xì)胞提取物或體外腺苷酸環(huán)化酶實(shí)驗(yàn)中的cAMP與固定數(shù)量的偶聯(lián)辣根過(guò)氧化物酶的cAMP或堿性磷酸酶競(jìng)爭(zhēng)性的結(jié)合抗cAMP單克l隆抗l體，已知的cAMP作為標(biāo)準(zhǔn)品來(lái)做標(biāo)準(zhǔn)曲線。經(jīng)過(guò)一段時(shí)間孵育，洗掉所有試劑，加入底物進(jìn)行顯色。將多孔板置于酶標(biāo)l儀上，于450nm或405nm波長(zhǎng)下，進(jìn)行讀數(shù)。黃色的光強(qiáng)度與樣品中cAMP的濃度呈反比關(guān)系?；赾AMP標(biāo)準(zhǔn)品所得曲線，通過(guò)測(cè)得的光密度可以計(jì)算出樣品中cAMP的濃度。

試劑準(zhǔn)備

1. 非乙酰化cAMP標(biāo)準(zhǔn)品

將5000 pmol/mL cAMP標(biāo)準(zhǔn)品溶液平衡至室溫。從#1至#6標(biāo)記六只潔凈試管。移取475μL 0.1M HCl到#1號(hào)試管，400μL到#2至#6號(hào)試管。加入25μL 5000 pmol/mL cAMP標(biāo)準(zhǔn)品到#1管中，劇烈渦旋震蕩。從#1管中取出100μL溶液至#2管中，渦旋震蕩。以此類推，重復(fù)上步操作，梯度稀釋至#6管。

經(jīng)以上操作，#1至#6管中cAMP標(biāo)準(zhǔn)品濃度分別為250,50，10,2,0.4和0.08 pmol/mL（詳見cAMP實(shí)驗(yàn)稀釋詳情鍵盤紙）。稀釋過(guò)的標(biāo)準(zhǔn)品需在30分鐘內(nèi)使用。

標(biāo)記一只試管作為無(wú)標(biāo)準(zhǔn)品空白對(duì)照（NSB）。移取600μL 0.1M HCl到NSB管中。

2. 洗滌液

將15 mL 10×洗滌液儲(chǔ)液加到135 mL去離子水中，稀釋成工作液。稀釋液可在室溫保存至試劑盒有效期限，或者3個(gè)月。

免l疫測(cè)定技術(shù)的基礎(chǔ)在于抗原抗l體之間的特異結(jié)合反應(yīng)，所以任何好的診斷l(xiāng)試劑離不開好的原料，如抗原抗l體，酶等。以前用于免l疫測(cè)定的抗原通常為各種純化抗原，而抗l體則為純化抗原免l疫動(dòng)物后獲得的多克l隆抗l體和使用雜交瘤技術(shù)得到的單克l隆抗l體，而抗原或抗l體的標(biāo)記物如酶標(biāo)結(jié)合物則通過(guò)各種化學(xué)合成方法制備。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，使用基因工程方法制備各種特殊的抗原或抗l體及其酶結(jié)合物等免l疫測(cè)定試劑幾成為現(xiàn)實(shí)的新一代試劑，各種新型使用的測(cè)定方法也不斷出現(xiàn)。

洗液不夠時(shí)，可用蒸餾水自行配制PH7.4，0.02M的磷酸緩沖液，加入0.1%的吐溫20作為洗液。加入1/1000的疊氮鈉后可長(zhǎng)期保存。

底物是光敏感的，要在臨用前現(xiàn)配。

檢測(cè)前，要打開酶l標(biāo)儀，使之穩(wěn)定10分鐘以上。

底物有一定的毒性，終止液對(duì)皮膚有腐蝕性，應(yīng)盡量避免接觸。

待檢樣品要澄清，否則會(huì)影響結(jié)果。

溫浴時(shí)間應(yīng)遵守試劑盒規(guī)定。

應(yīng)盡量做雙孔實(shí)驗(yàn)，這樣才能保證數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。

對(duì)結(jié)果有疑問(wèn)的樣品要用其它方法進(jìn)行確證。