這些抗Arf 6-GTP單克l隆抗l體還可用于通過(guò)免l疫組織化學(xué)監(jiān)測(cè)細(xì)胞和組織中Arf 6的激l活。

NewEast Biosciences Arf6激l活測(cè)定試劑盒提供了一種簡(jiǎn)單且快速的方法來(lái)監(jiān)測(cè)Arf 6的激l活。每個(gè)試劑盒均提供足夠的量以執(zhí)行20個(gè)測(cè)定。

NewEast Biosciences Arf 6激l活檢測(cè)試劑盒基于特定于配置的抗Arf 6-GTP單克l隆抗l體，可從細(xì)胞提取物或體外載有GTPγS的Arf 6激l活檢測(cè)方法來(lái)測(cè)量活性Arf 6-GTP水平。 簡(jiǎn)而言之，抗活性的Arf 6小鼠單克l隆抗l體將與含有Arf 6-GTP的細(xì)胞裂解液一起孵育。 然后，結(jié)合的活性Arf 6將被蛋白A / G瓊脂糖拉低。 分別使用抗Arf 6兔多克l隆抗l體通過(guò)免l疫印跡分析檢測(cè)沉淀的活性Arf 6。

試劑準(zhǔn)備

?1X測(cè)定/裂解緩沖液：短暫混合5X儲(chǔ)備液，并在去離子水中稀釋至1X。 在使用前，添加蛋白酶抑制l劑，例如1 mM PMSF，10 μg / mL亮肽素和10 μg / mL抑肽酶。

1.將細(xì)胞（一塊10厘米長(zhǎng)的平板，約107個(gè)細(xì)胞）培養(yǎng)至約80-90％匯合。根據(jù)需要用活化劑或抑制l劑刺激細(xì)胞。

2.吸出培養(yǎng)基，并用冰冷的PBS洗滌兩次。

3.完全除去PBS洗滌液，然后向細(xì)胞中加入冰冷的1X分析/裂解緩沖液（每10 cm組織培養(yǎng)板0.5-1 mL）。

4.將培養(yǎng)板放在冰上10-20分鐘。

5.用刮板將其從平板上取下。

6.將裂解物轉(zhuǎn)移至適當(dāng)大小的試管中，并置于冰上。

7.如果發(fā)生核裂解，則細(xì)胞裂解液可能變得非常粘稠，難以移液。如果發(fā)生這種情況，可將裂解液通過(guò)27?號(hào)注l射器針頭3-4次以剪切基因組DNA。

8.通過(guò)離心10分鐘（在4°C下為12,000 x g）清除裂解物。

9.收集上清液并將樣品（約1-2 mg的總蛋白）存儲(chǔ)在冰上以立即使用，或速凍并存儲(chǔ)在-70°C以便將來(lái)使用。

 1.抗活性的Arl1，小鼠單克l隆抗l體（貨號(hào)26924）：一小瓶–溶于pH 7.4的PBS中的22 μL（1mg / ml），含有50％甘油和0.05％疊氮l化鈉。該抗l體特異性識(shí)別所有脊椎動(dòng)物的Arl1-GTP。

2.蛋白A / G瓊脂糖（目錄號(hào)30301）：一小瓶– 400 μL 50％漿液。

3. 5X測(cè)定/裂解緩沖液（目錄號(hào)30302）：一瓶– 30 mL的250 mM Tris-HCl，pH 8，750mM NaCl，50 mM MgCl2，5 mM EDTA，5％Triton X-100。

4.抗Arl1，小鼠單克l隆抗l體（目錄號(hào)26056）：一小瓶– 100 μL（1 mg / ml）

pH 7.4的PBS中含有50％的甘油。

5. 100 XGTPγS（貨號(hào)30303）：1瓶– 100 μl，10 mM，使用5 μLGTPγSGTP標(biāo)記的0.5 mL細(xì)胞裂解物。

6. 100 X GDP（產(chǎn)品目錄號(hào)30304）：一個(gè)樣品瓶– 100 μl，100 mM，使用5 μL GDP

GDP標(biāo)記的0.5 mL細(xì)胞裂解物。

1.刺激的和非刺激的細(xì)胞裂解液

2.蛋白酶抑制l劑

3. 4°C管搖桿或搖床

4. 0.5 M EDTA，pH8.0

5. 1 M氯化鎂

6. 2倍還原SDS-PAGE樣品緩沖液

7.電泳和免l疫印跡系統(tǒng)

8.免l疫印跡洗滌緩沖液，例如TBST（10 mM Tris-HCl，pH 7.4，0.15 M NaCl，0.05％Tween-20）

9.免l疫印跡封閉緩沖液（TBST包含5％脫脂奶粉或3％BSA）

10. PVDF或硝l酸纖維素膜

11.二抗

12. ECL檢測(cè)試劑

?1X測(cè)定/裂解緩沖液：短暫混合5X儲(chǔ)備液，并在去離子水中稀釋至1X。 在使用前，添加蛋白酶抑制l劑，例如1 mM PMSF，10 μg / mL亮肽素和10 μg / mL抑肽酶。