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固相萃取(Solid Phase Extraction，簡稱 SPE)是一種以液-固色譜分離為基礎(chǔ)的前處理技術(shù)，可對目標(biāo)化合物進(jìn)行選擇性吸附和選擇性洗脫。按保留機理，力主要分為無極力作用、極力作用、離子交換(靜電吸引)。

反相態(tài)是 SPE小柱中相對于流動相極性較低的分離態(tài)。本發(fā)明主要利用固定相官能團(tuán)的碳?xì)滏I和目標(biāo)化合物的碳?xì)滏I之間的非極性作用力，適合從極性基質(zhì)中提取分離非極性和中極性的目標(biāo)物。

對由非極性力吸附到反相 SPE柱上的目標(biāo)物，可用弱極性溶劑，如氯1仿、環(huán)己1烷、乙1酸乙1酯等洗脫。只有當(dāng)溶劑的洗脫強度足夠大時，才能使目標(biāo)物與吸附劑之間的范德華力破壞，使目標(biāo)物從 SPE柱洗脫。即使是極性更強的甲1醇，對許多化合物而言，也有足夠的非極性力量來洗脫它。有時候，單種溶劑無法徹底洗脫疏水性強的目標(biāo)物，可以考慮使用二1氯甲1烷：乙1酸乙1酯(1:1，體積比)。

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正相填充(Silica,NH2, CN, Florisil, Diol, Carb,Alumina-N, A, B)

*分析物：中等極性至強極性

*基質(zhì)：從非極性到中極性

·方法：

(a)激1活：非極性有機溶1劑(通常由上樣液所在的有機溶1劑激1活)

(b)洗脫：非極性有機溶1劑(一般是上樣液所在的有機溶1劑)

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在 pH和 pKa相同的情況下，[a]/[HA]為1。這就是說，此時50%弱酸性化合物是陰離子態(tài)，另50%為中性態(tài)。這種 pH環(huán)境下，即使這些呈陰離子狀態(tài)的化合物地被陰離子交換劑吸附，然后地洗脫，也只能得到50%的回收率。由于只有50%的弱酸化合物處于離子狀態(tài)，所以被陰離子交換劑吸附。因此，控制環(huán)境 pH值對于離子交換固相萃取非常重要。

較弱的酸性化合物離子化的程度越高，代表了較強的[A=/[HA]。從理論上講，當(dāng)[A]/[HA]等于100時，99%的弱酸性化合物都是陰離子，并且能被陰離子交換劑吸附。按照式三，要使弱酸性化合物在陰離子固相萃取吸附時99%的離子化，樣品基質(zhì)的 pH值應(yīng)高于化合物 pKa至少兩個 pH單位。

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對污染的 HPLC柱進(jìn)行再生的關(guān)鍵是要了解污染物的性質(zhì)，并找出合適的溶劑。

若污染物是由于重復(fù)進(jìn)樣時強保留物質(zhì)的積累所致，則采用簡單的清洗步驟去除污染物后，通?？梢曰謴?fù)色譜特性。在色譜柱中，有時使用90~含量的溶劑 B (雙溶劑反相系統(tǒng)中較強的洗脫能力的溶劑，如甲i醇、乙晴、四氫呋i喃等)沖洗20個柱，可除去污染物(色譜柱的柱體積與空柱管體積概念不同，其柱體積為4.6x250mm，而柱2.1x150mm則為0.28 ml)。若采用緩沖鹽制，則不能直接轉(zhuǎn)換為強溶劑，而突然轉(zhuǎn)換為高濃度有i機溶劑，則可能造成 HPLC流動體系中緩沖鹽分沉淀，從而造成柱篩板堵塞、連接管堵塞、泵泄漏、活塞損壞或進(jìn)樣閥轉(zhuǎn)軸失效等嚴(yán)重問題。應(yīng)首先使用無緩沖鹽的流動相(即將緩沖液換成水)，沖洗5~10柱體積后再切換使用強溶劑清洗。

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聚乙烯醇小柱活化平衡的目的有二，一是使官能團(tuán)填料的粘附性和伸縮性保持對目標(biāo)化合物的大吸附活性，另一種目的是去除填料本身可能引入的雜質(zhì)。硅膠鍵合C18，是一種在硅膠微球表面粘結(jié)的疏水性C18官能團(tuán)，為使其對目標(biāo)物保持充分吸附活性，需要在濕潤環(huán)境上樣物在填料表層形成的液膜(活化平衡)與上樣物的溶劑分子具有良好的相容性，目標(biāo)物在膜間進(jìn)行傳質(zhì)，與膠接C18發(fā)生疏水作用時，目標(biāo)物與膠接C18本身并不具有水浸潤性，直接上樣物，C18蜷縮，而較強的疏水性則使其難以與目標(biāo)物中的目標(biāo)物分子充分接觸，因此， HLB小柱采用聚合物改性材料，增加了親水基團(tuán)，使其在上樣物的環(huán)境中與目標(biāo)物分子充分接觸，而發(fā)生傳質(zhì)，使目標(biāo)物在上樣物的環(huán)境中完全保留。

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反相萃取通常用于化合物的預(yù)處理，正如反相色譜是色譜中常用的分離方法一樣，反相萃取中的淋洗液通常是一種水相或含水的緩沖溶液，除去水分后，可方便地進(jìn)行干燥、濃縮。

有些項目，在淋洗步驟完成后，直接用一定量的洗脫液，如1 ml洗脫，這個過程中洗脫和定容集是一步處理，前一步處理必然會影響洗脫步驟的定量結(jié)果。

也就是溶劑互溶問題，當(dāng)淋洗過程中使用的溶劑極性與洗脫溶劑極性的差別較大時，就會產(chǎn)化分層，洗脫阻力大，洗脫液容易被稀釋等問題，造成洗脫效果不同，從而導(dǎo)致試驗結(jié)果。

固相萃取小柱 SPE工藝的基本步驟：

上樣：將預(yù)處理過的樣品倒入活化的 SPE小柱中，然后采用加壓、抽真空或離心等方法，使液體樣品在 SPE小柱中以適當(dāng)速度流過。淋洗：選擇強度適中的混合溶劑，在可能情況下清洗去除干擾組分，而不會導(dǎo)致目標(biāo)萃取物流喪失；洗脫：用小體積的適當(dāng)洗脫溶劑洗脫和收集分析物；將干燥溶劑備用或直接在線分析。

洗脫劑的強度選擇非常重要，要達(dá)到分析物盡可能地被洗脫而吸附比分析物強的雜質(zhì)仍然留在 SPE小柱上而不被洗脫的效果。

選用 SPE柱規(guī)格的原則是，首先要確保 SPE柱的填料具有足夠的容量，以便將目標(biāo)化合物100%保留在柱體上。另外，填料也不易過量。

填充物越多，溶劑對目標(biāo)化合物的洗脫效果就越好。所以在選擇 SPE柱規(guī)格時，一定要考慮 SPE柱的容量。柱容是指一單位質(zhì)量的填料以主要力保持其質(zhì)量。

鍵合型硅膠柱容量一般為1%~5%。例如， SPE柱的填料為100 mg，其大容量一般不超過5 mg。該離子交換劑柱容量約為0.5~1.5 meq/g。