DNA限制性內(nèi)切酶酶切

影響條件：DNA純度、緩沖液、溫度條件及限制性內(nèi)切酶本身都會(huì)影響限制性內(nèi)切酶的活性。大部分限制性內(nèi)切酶不受RNA或單鏈DNA的影響。

處理方法：當(dāng)微量的污染物進(jìn)入限制性內(nèi)切酶貯存液中時(shí)，會(huì)影響其進(jìn)一步使用，因此在吸取限制性內(nèi)切酶時(shí)，每次都要用新的吸管頭。如果采用兩種限制性內(nèi)切酶，必須要注意分別提供各自的zui適鹽濃度。若兩者可用同一緩沖液，則可同時(shí)水解。若需要不同的鹽濃度，則低鹽濃度的限制性內(nèi)切酶必須首先使用，隨后調(diào)節(jié)鹽濃度，再用高鹽濃度的限制性內(nèi)切酶水解。也可在第yi個(gè)酶切反應(yīng)完成后，用等體積酚/氯1仿抽提，加0.1倍體積3mol/L NaAc和2倍體積無水乙醇，混勻后置-70℃低溫冰箱30分鐘，離心、干燥并重新溶于緩沖液后進(jìn)行第二個(gè)酶切反應(yīng)。

一般是以微生物屬名的第yi個(gè)字母和種名的前兩個(gè)字母組成，第四個(gè)字母表示菌株（品系）。例如，快切酶，從Bacillus amylolique faciens H中提取的限制性內(nèi)切酶稱為Bam H，在同一品系細(xì)菌中得到的識(shí)別不同堿基順序的幾種不同特異性的酶，可以編成不同的號(hào)，如HindⅡ、HindⅢ，HpaI、HpaⅡ，MboI、MboⅡ等。

別名：restriction endonuclease簡(jiǎn)稱限制酶

酶反應(yīng)：限制性內(nèi)切酶能分裂DNA分子在一限定數(shù)目的專一部位上。它能識(shí)別外源DNA并將其降解。

單位定義：在指明pH與37℃，在0.05mL反應(yīng)混合物中，1小時(shí)消化1μg的λDNA的酶量為1單位。

性狀制品不含非專一的核酸水解酶（由10單位內(nèi)切酶與1μg λDNA，保溫16小時(shí)所得的凝膠電泳圖譜的穩(wěn)定性表示），這類酶主要是從原核生物中分離出來的，迄今已經(jīng)從近300多種不同的微生物中分離出約4000種限制酶。

限制性內(nèi)切酶能特異地結(jié)合于一段被稱為限制性酶識(shí)別序列的DNA序列之內(nèi)或其附近的特異位點(diǎn)上，并切割雙鏈DNA。它可分為三類：

Ⅰ類和Ⅲ類酶在同一蛋白質(zhì)分子中兼有切割和修飾（甲1基化）作用且依賴于ATP的存在。Ⅰ類酶結(jié)合于識(shí)別位點(diǎn)并隨機(jī)的切割識(shí)別位點(diǎn)不遠(yuǎn)處的DNA，而Ⅲ類酶在識(shí)別位點(diǎn)上切割DNA分子，然后從底物上解離。

Ⅱ類由兩種酶組成： 一種為限制性內(nèi)切核酸酶（限制酶），它切割某一特異的核苷酸序列； 另一種為獨(dú)立的甲1基化酶，它修飾同一識(shí)別序列。Ⅱ類中的限制性內(nèi)切酶在分子克1隆中得到了廣泛應(yīng)用，它們是重組DNA的基礎(chǔ)。絕大多數(shù)Ⅱ類限制酶識(shí)別長(zhǎng)度為4至6個(gè)核苷酸的回文對(duì)稱特異核苷酸序列（如EcoRⅠ識(shí)別六個(gè)核苷酸序列：5"- G↓AATTC-3"），有少數(shù)酶識(shí)別更長(zhǎng)的序列或簡(jiǎn)并序列。Ⅱ類酶切割位點(diǎn)在識(shí)別序列中，有的在對(duì)稱軸處切割，產(chǎn)生平末端的DNA部分片段（如SmaⅠ：5"-CCC↓GGG-3"）；有的切割位點(diǎn)在對(duì)稱軸一側(cè)，產(chǎn)生帶有單鏈突出末端的DNA部分片段稱粘性末端，如EcoRⅠ切割識(shí)別序列后產(chǎn)生兩個(gè)互補(bǔ)的粘性末端。

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