腺病毒的分類

分類及自上個(gè)世紀(jì)50年代發(fā)現(xiàn)并成功分離腺病毒以來(lái)，已陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了100余個(gè)血1清型，其中人腺病毒有52種，分為A、B、C、D、E和F六個(gè)亞群（subgroup）。基因cure常用的人的2型及5型腺病毒在血1清學(xué)分類上均屬C亞群，在DNA序列上有95%的同源性。二者的增殖能力非常強(qiáng)，滴度通?？梢赃_(dá)到109pfu (plaque forming unit)/ml，逆轉(zhuǎn)錄病毒滴度測(cè)定，其在單個(gè)細(xì)胞中的基因組拷貝數(shù)可達(dá)104（約占細(xì)胞總DNA的10%）。病毒顆粒比較穩(wěn)定，通過(guò)CsCl梯度離心可以達(dá)到1010~1011pfu/ml，滿足動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的要求。

腺病毒是無(wú)胞膜的線性雙鏈DNA病毒，目前腺病毒科分為5個(gè)屬，有多種型別的腺病毒已經(jīng)被開(kāi)發(fā)為基因轉(zhuǎn)移載體，在基礎(chǔ)科研、基因cure和載體疫1苗領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。

腺病毒的基因組長(zhǎng)約26-46kb，這使得腺病毒載體的構(gòu)建與常見(jiàn)質(zhì)粒載體(一般長(zhǎng)度小于10kb)不同。太長(zhǎng)的基因組使得在腺病毒載體上富集一個(gè)多克1隆位點(diǎn)非常困難。針對(duì)重組腺病毒的構(gòu)建，開(kāi)發(fā)了多種方法。

目前已有的腺病毒載體系統(tǒng)均存在缺陷，有些構(gòu)建步驟繁瑣，耗時(shí)較長(zhǎng)，有些在重組病毒中引入了不必要的外源序列，有些不能用于重組腺病毒的反向遺傳改造。近年來(lái)，新的生物特性不同的腺病毒不斷被發(fā)現(xiàn)，因此，本領(lǐng)域?qū)?gòu)建過(guò)程更加快捷簡(jiǎn)便的、人工改造更加方便靈活的腺病毒載體系統(tǒng)和重組病毒構(gòu)建方法存在需求。

電1擊法

　　電1擊法基本原理是電脈沖使細(xì)胞膜產(chǎn)生可逆性的“微孔”，外源DNA可通過(guò)這些微孔進(jìn)入受體細(xì)胞原生質(zhì)體內(nèi)。

　　1985年Fromm等用electric shock法將pat基因?qū)肓擞衩自|(zhì)體，得到了該基因穩(wěn)定表達(dá)的愈傷組織。隨著玉米原生質(zhì)體再生技術(shù)的研究取得進(jìn)展，1988年Rhodes等用electric shock法轉(zhuǎn)化玉米原生質(zhì)體，初步獲得了完整的轉(zhuǎn)0基因植株。electric shock法還可以對(duì)幼胚、愈傷組織和胚性懸浮細(xì)胞系進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。1992年D’Hallum K等以玉米幼胚和愈傷組織為受體，用electric shock法導(dǎo)入neo基因，獲得了可育的轉(zhuǎn)0基因植株，并且neo基因能穩(wěn)定地遺傳給后代。1993年Sukhapinda等用electric shock法轉(zhuǎn)化從玉米花粉愈傷組織分離的原生質(zhì)體，將gusA和nptⅡ轉(zhuǎn)入原生質(zhì)體，獲得單倍體轉(zhuǎn)化植株。1994年Laursen等以果膠降解酶處理懸浮細(xì)胞系后，通過(guò)electric shock法導(dǎo)入bar基因，也獲得了可育的轉(zhuǎn)0基因玉米。

　　電1擊法操作簡(jiǎn)單，不受宿主限制，在遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)研究的初期得到了較為廣泛的應(yīng)用，但是它的轉(zhuǎn)化效率較低，而且對(duì)有壁細(xì)胞或組織的轉(zhuǎn)化效果較差。

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