PCR的創(chuàng)建

Khorana (1971)等zui早提出核酸體外擴(kuò)增的設(shè)想：“經(jīng)DNA變性，與合適的引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復(fù)該過程便可合成tRNA基因。”但由于當(dāng)時(shí)基因序列分析方法尚未成熟，PCR Buffer，熱穩(wěn)定DNA聚合酶尚未報(bào)道以及引物合成的困難，這種想法似乎沒有實(shí)際意義。加上分子克1隆技術(shù)的出現(xiàn)提供了一種克1隆和擴(kuò)增基因的途徑，所以Khorana的設(shè)想被人們遺忘了。

1983年4月的一個(gè)星期五晚上，他開車去鄉(xiāng)下別墅的路上，猛然閃現(xiàn)出“多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)”的想法。

1983年12月，Mullis用同位素標(biāo)記法看到了10個(gè)循環(huán)后的49 bp長度的第yi個(gè)PCR片段；

1985年，Kary Mullis在Cetus公司工作期間，發(fā)明了PCR。Mullis要合成DNA引物來進(jìn)行測序工作，卻常為沒有足夠多的模板DNA而煩惱。

1985年10月25日申請(qǐng)了PCR的專1利，

1987年7月28日批準(zhǔn)（專1利號(hào)4，683，202 ），Mullis是第yi個(gè)發(fā)明人；

1985年12月20日在Science雜志上發(fā)表了第yi篇PCR的學(xué)術(shù)論1文，Mullis是共同作者；

1986年5月，Mullis在冷泉港實(shí)驗(yàn)室做專題報(bào)告，全世界從此開始學(xué)習(xí)PCR的方法。

 PCR技術(shù)的基本原理

PCR技術(shù)是在模板DNA、引物和四種dNTP等存在的條件下.依賴于DNA聚合酶(T aq酶)的酶.促合成反應(yīng)。其具體反應(yīng)分三步:變性、退火、聚合。以上三步為一個(gè)循環(huán)，每一 循環(huán)的產(chǎn)物DNA又可以作為下一個(gè)循環(huán)模板，數(shù)小時(shí)后，介于兩個(gè)引物之間的目的DNA得到了大量的copy，經(jīng)25~ 30次循環(huán)DNA數(shù)量可達(dá)2x1067拷貝數(shù)。

錨定PCR(Anchored PCR. APCR技術(shù).

用酶法在一通用引物反轉(zhuǎn)錄cDNA3"-末端加上一段已知序列，然后以此序列為引物結(jié)合位點(diǎn)對(duì)該cDNA進(jìn)行擴(kuò)增，稱為APCR.應(yīng)用:它可用于擴(kuò)增未知或全知序列，如未知cDNA的制備及低豐度cDNA文庫的構(gòu)建。

PCR原理

DNA的半保留copy是生物進(jìn)化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解旋成單鏈，在DNA聚合酶的參與下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則復(fù)1制成同樣的兩分子拷貝。在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，DNA在高溫時(shí)也可以發(fā)生變性解鏈，當(dāng)溫度降低后又可以復(fù)性成為雙鏈。因此，通過溫度變化控制DNA的變性和復(fù)性，加入設(shè)計(jì)引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外copy。

但是，DNA聚合酶在高溫時(shí)會(huì)失活，因此，每次循環(huán)都得加入新的DNA聚合酶，不僅操作煩瑣，而且價(jià)格昂貴，制約了PCR技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展。

耐熱DNA聚合酶-Taq酶的發(fā)現(xiàn)對(duì)于PCR的應(yīng)用有里程碑的意義，該酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活，不需要每個(gè)循環(huán)加酶，使PCR技術(shù)變得非常簡捷、同時(shí)也大大降低了成本，PCR技術(shù)得以大量應(yīng)用，并逐步應(yīng)用于臨床。

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