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基因(遺傳因子)是產(chǎn)生一條多肽鏈或功能RNA所需的全部核苷酸序列?;蛑С种幕緲?gòu)造和性能。儲(chǔ)存著生命的種族、血型、孕育、生長、凋亡等過程的全部信息。環(huán)境和遺傳的互相依賴,演繹著生命的繁衍、細(xì)胞分裂和蛋白質(zhì)合成等重要生理過程。生物體的生、長、衰、病、老、死等一切生命現(xiàn)象都與基因有關(guān)。它也是決定生命健康的內(nèi)在因素。因此,基因具有雙重屬性:物質(zhì)性(存在方式)和信息性(根本屬性)。帶有遺傳信息的DNA段稱為基因,其他的DNA序列,有些直接以自身構(gòu)造發(fā)揮作用,有些則參與調(diào)控遺傳信息的表現(xiàn)。組成簡單生命少要265到350個(gè)基因。(這涉及基因工作組的力量,人類的基因工作組與果蠅的基本相似)
腺病毒表達(dá)
腺病毒系統(tǒng)是很受歡迎的可以在任何哺乳動(dòng)物細(xì)胞中有效瞬時(shí)表達(dá)的基因遞送平臺(tái)。對于難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞,如原代或非分裂細(xì)胞,采用病毒遞送外源基因的方式是非常有效的選擇。鐘鼎生物采用293A腺病毒包裝細(xì)胞系(含有腺病毒包裝所必需的E1基因序列,逆轉(zhuǎn)錄病毒滴度測定,是專為生產(chǎn)腺病毒和進(jìn)行滴度測定而建立的),用于高滴度的copy缺陷型(E1和E3缺失)腺病毒的生產(chǎn),以進(jìn)行外源基因的表達(dá)。腺病毒感1染幾乎所有的細(xì)胞類型,除了一些抗腺病毒感1染的淋巴1瘤細(xì)胞。腺病毒是研究原代非增殖細(xì)胞基因表達(dá)的zui佳系統(tǒng),它可以使轉(zhuǎn)化細(xì)胞和原代細(xì)胞中得到的結(jié)果直接進(jìn)行對比;不整合到染色體中,無插入致突變性。能有效進(jìn)行增殖,滴度高:腺病毒系統(tǒng)可產(chǎn)生108 pfu/ml原液,濃縮后可達(dá)1010-1011 VP/ml,這一特點(diǎn)使它非常適用于基因cure。
典型的腺病毒載體系統(tǒng)如:穿梭質(zhì)粒pCA13/腺病毒基因組質(zhì)粒pBHG11/包裝細(xì)胞293細(xì)胞。pCA13/的HCMV IE啟動(dòng)子-多克1隆位點(diǎn)-SV40 AN(poly A)構(gòu)成外源基因的表達(dá)盒,該表達(dá)盒的插入使腺病毒E1基因缺失,但是保留其兩端側(cè)翼序列(左側(cè)的1~3bp的ITR,右側(cè)從3.5kb到末端的維持病毒裝配和活力必須的蛋白IX的基因),也保留了腺病毒的包裝信號
φ(194~358bp);pBHG11則保留了腺病毒基因組的絕大部分,但是缺失了包裝信號φ、0.5~3.7圖距(mu)部分的E1區(qū)、77.5~86.2mu的E3區(qū),293細(xì)胞是整合有Ad5 E1基因的人胚shen細(xì)胞系。pBHG11因?yàn)槿笔Оb信號及E1區(qū)而不能copy,pCA13帶有包裝信號及E1的側(cè)翼序列,但是缺失E1區(qū)及腺病毒絕大部分基因組,同樣不能copy。外源目的基因插入pCA13后,與pBHG11共轉(zhuǎn)染,進(jìn)入293細(xì)胞。pCA13與pBHG11在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生同源重組,同時(shí),293細(xì)胞提供E1蛋白,從而包裝產(chǎn)生腺病毒顆粒。該病毒的蛋白質(zhì)外殼同野1生型腺病毒相似,具有同樣的感1染力進(jìn)入靶1細(xì)胞的能力,但是基因組DNA的E1區(qū)被外源目的基因取代,即進(jìn)入靶1細(xì)胞后病毒不能copy,但可以表達(dá)目的蛋白。
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