限制性核酸內(nèi)切酶是可以識別并附著特定的核苷酸序列，并對每條鏈中特定部位的兩個脫氧核糖核苷酸之間的磷酸二酯鍵進(jìn)行切割的一類酶，簡稱限制酶。根據(jù)限制酶的結(jié)構(gòu)，輔因子的需求切位與作用方式，可將限制酶分為三種類型，分別是型（Type I）、第二型（Type II）及第三型（Type III）。Ⅰ型限制性內(nèi)切酶既能催化宿主DNA的化，又催化非化的DNA的水解；而Ⅱ型限制性內(nèi)切酶只催化非化的DNA的水解。Ⅲ型限制性內(nèi)切酶同時具有修飾及認(rèn)知切割的作用。

　　非特異性內(nèi)切酶鑒定

　　為鑒定非特異性內(nèi)切酶污染，限制性內(nèi)切酶與缺少該酶識別序列的超螺旋DNA底物溫育。對于RF I型DNA(超螺旋形式)，一個單一的非特異性缺口就會將它轉(zhuǎn)變成RF II型DNA(帶缺口環(huán)狀)。小份的限制性內(nèi)切酶與1μgDNA在50μl反應(yīng)體系中，采用推薦的NEBuffer，在推薦的溫度下溫育4小時。兩種形式的DNA在瓊脂糖凝膠上很容易區(qū)分，可以計算出從RF I 到 RF II的轉(zhuǎn)化率。

限制性內(nèi)切酶能特異地結(jié)合于一段被稱為限制性酶識別序列的DNA序列之內(nèi)或其附近的特異位點上，并切割雙鏈DNA。它可分為三類：

Ⅰ類和Ⅲ類酶在同一蛋白質(zhì)分子中兼有切割和修飾（甲1基化）作用且依賴于ATP的存在。Ⅰ類酶結(jié)合于識別位點并隨機(jī)的切割識別位點不遠(yuǎn)處的DNA，而Ⅲ類酶在識別位點上切割DNA分子，然后從底物上解離。

Ⅱ類由兩種酶組成： 一種為限制性內(nèi)切核酸酶（限制酶），它切割某一特異的核苷酸序列； 另一種為獨立的甲1基化酶，它修飾同一識別序列。Ⅱ類中的限制性內(nèi)切酶在分子克1隆中得到了廣泛應(yīng)用，它們是重組DNA的基礎(chǔ)。絕大多數(shù)Ⅱ類限制酶識別長度為4至6個核苷酸的回文對稱特異核苷酸序列（如EcoRⅠ識別六個核苷酸序列：5"- G↓AATTC-3"），有少數(shù)酶識別更長的序列或簡并序列。Ⅱ類酶切割位點在識別序列中，有的在對稱軸處切割，快切酶，產(chǎn)生平末端的DNA部分片段（如SmaⅠ：5"-CCC↓GGG-3"）；有的切割位點在對稱軸一側(cè)，產(chǎn)生帶有單鏈突出末端的DNA部分片段稱粘性末端，如EcoRⅠ切割識別序列后產(chǎn)生兩個互補(bǔ)的粘性末端。

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