梯度PCR儀

把一次性PCR擴(kuò)增可以設(shè)置一系列不同的退火溫度條件（溫度梯度），PCR Buffer，通常12鐘溫度梯度，這樣的儀器就叫梯度PCR儀。

工作模式和原理同普通PCR儀一樣，它出了又普通PCR儀的功能外還多了一個梯度退火功能。DNA部分片段的擴(kuò)增對溫度的控制精度要求特別高，不同的DNA部分片段其退火溫度不一樣，通過計算DNA部分片段中的CG堿基的含量只能初步的判斷出zui優(yōu)退火溫度在 5℃范圍內(nèi)，如果用普通PCR儀進(jìn)行研究，需重復(fù)擴(kuò)增很多次，然后做電泳進(jìn)行分析來確定zui優(yōu)退火溫度。而梯度PCR儀則只需要一次就可以完成，在節(jié)省了時間的同時提高了實驗的可靠性和準(zhǔn)確性。主要用于研究未知DNA退火溫度的擴(kuò)增，這樣節(jié)約成本的同時也節(jié)約了時間和經(jīng)費(fèi)。在不設(shè)置梯度的情況下，梯度PCR儀也可以做普通PCR擴(kuò)增。

該儀器主要應(yīng)用于科研，教學(xué)機(jī)構(gòu)，醫(yī)學(xué)臨床研究，高等院校，病毒分析，疾控中心等。

PCR法不僅僅局限于分子生物學(xué)，還因其簡便、迅速等特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、法醫(yī)學(xué)、食品、環(huán)境衛(wèi)生檢驗、動植物檢驗等其它領(lǐng)域。Taq DNA聚合酶是PCR法普遍使用的聚合酶，但其具有如下局限性。

1. 可信度 (Fidelity)：通常Taq DNA Polymerase的Fidelity并不高，PCR反應(yīng)有時會出現(xiàn)錯配 (Misincorporation) 現(xiàn)象，因而PCR克1隆、變異導(dǎo)入等實驗中，需加以注意。

2. 擴(kuò)增的DNA長度：使用Taq DNA Polymerase進(jìn)行PCR擴(kuò)增時，通?？蓴U(kuò)增幾kb的DNA，超過10 kb則比較困難。這就給利用PCR進(jìn)行Mapping等Genome解析帶來麻煩。

3. 擴(kuò)增量：使用Taq DNA Polymerase進(jìn)行PCR產(chǎn)物克1隆及食品、環(huán)境衛(wèi)生檢驗等時，擴(kuò)增量常常達(dá)不到要求。為解決以上難題，Takara在對Polymerase、Buffer及反應(yīng)條件等進(jìn)行深入研究的基礎(chǔ)上，開發(fā)了LA PCR (Long and Accurate PCR) 技術(shù)，運(yùn)用此技術(shù)可大量正確地擴(kuò)增長達(dá)40 kb 的DNA部分片段。LA PCR技術(shù)擴(kuò)展了PCR的應(yīng)用范圍，可在Genome解析、基因診斷、長片段 DNA的克1隆及變異導(dǎo)入等方面發(fā)揮優(yōu)勢。

pcr擴(kuò)增的原理

實驗方法原理

①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至94℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)做準(zhǔn)備；

②模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對結(jié)合；

③引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在Taq酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留copy原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)1制鏈。

重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)1制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需2～4分鐘， 2～3小時就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍。

典型的PCR包括高溫變性、低溫退火、中溫延伸三個步驟，通過將這一套過程不斷循環(huán)，使DNA得以成百萬倍的擴(kuò)增。

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