水中微生物DNA提取試劑盒，樣本制備步驟。

步驟1. 樣本過濾

1.1 從試劑盒中小心取出濾膜。用水樣潤濕濾膜。

1.2 將濾膜放置在濾器中，并過濾必要體積的水樣。

步驟2. 菌體裂解

* 提前準(zhǔn)備：預(yù)先將恒溫儀設(shè)置到70℃，將恒溫箱設(shè)置到37℃。

2.1將樣本過濾后的濾膜翻轉(zhuǎn)放置到試劑盒提供的IncubationDish（平皿）中。

2.2 吸取2mllysis buffer（裂解液），并加到濾膜上。

2.3 將濾膜浸泡在裂解液中，小心搖勻平皿并在37°C孵育30分鐘。

2.4 用平皿中的裂解液沖洗濾膜，并搖晃平皿10秒鐘。

2.5 將平皿中的400μl裂解液轉(zhuǎn)移至IncubationTube（孵育管），70°C孵育10分鐘。

2.6 樣本短暫離心，并加入400μl Binding Buffer（結(jié)合液），立即渦旋充分混勻，以防止DNA沉淀。請(qǐng)勿離心樣本，并立即進(jìn)行下一步。

步驟3. DNA提取

3.1 將步驟2.6中的混合液（~800μl）轉(zhuǎn)移到CollectionTube（收集管）內(nèi)的SpinColumn（離心柱）中，小心液體不要沾到離心柱的邊緣。

3.2 離心柱離心≥10000× g，1分鐘。棄掉收集管中的液體。重新將離心柱插到原有的收集管中。

3.3 離心柱中加入500μl洗液1。離心≥10000×g，1分鐘。棄掉收集管中的液體。重新將離心柱插到原有的收集管中。

3.4 離心柱中加入500μl洗液2。離心≥10000×g，1分鐘。棄掉收集管中的液體。將離心柱插到一個(gè)新的收集管中。

3.5 zui大速度離心3分鐘，以去除殘留的洗液2。

3.6 棄掉收集管。

3.7 吸取60μl已70℃預(yù)熱的洗脫液，直接加到離心柱的硅膠膜上。硅膠膜表面應(yīng)全部覆蓋洗脫液。

3.8 室溫靜置2分鐘，然后離心8000×g，2分鐘，以洗脫DNA。

3.9 樣本保存管中的洗脫液即包含DNA，可直接用于PCR，或儲(chǔ)存在2~8℃，可存放1周。長期儲(chǔ)存是在≤-18℃。

選擇素elisa試劑盒的實(shí)驗(yàn)原理

選擇素elisa試劑盒是一類異親型結(jié)合、Ca2 依賴的細(xì)胞粘著分子，果實(shí)RNA提取，能與特異糖基識(shí)別并結(jié)合。主要參與白細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的識(shí)別與粘著。

實(shí)驗(yàn)原理：

將目標(biāo)包被于96孔微孔板中，制成固相載體，向微孔中分別加入品或標(biāo)本，其中的目標(biāo)連接于固相載體上的結(jié)合，然后加入微生物化的目標(biāo)，將未結(jié)合的生物素洗凈后，加入HRP標(biāo)記和親和素，再次洗滌后加入TMB底物顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成終的。顏色的深淺和樣品中的目標(biāo)呈正相關(guān)。用酶1標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（O.D.值），計(jì)算樣品濃度。

精密度：精密度用樣品測定值的變異系數(shù)CV表示。CV（%）=SD/mean×100

批內(nèi)差：取同批次選擇素elisa試劑盒對(duì)低、中、高值定值樣本進(jìn)行定量檢測，每份樣本連續(xù)測定20次，分別計(jì)算不同濃度樣本的平均值及SD值。

批間差：選取3個(gè)不同批次的試劑盒分別對(duì)低、中、高值定值樣本定量測定，每個(gè)樣本使用同一試劑盒重復(fù)測定8次，分別計(jì)算不同濃度樣本的平均值及SD值。

批內(nèi)差： CV<10% Inter-批間差： CV<13%

經(jīng)測定，試劑盒在X期內(nèi)按推薦溫度保存，其活性率小于5%。為減小外部因素對(duì)試劑盒前后檢測值的影響，實(shí)驗(yàn)室的條件需盡量保持一致，尤其是實(shí)驗(yàn)室內(nèi)溫度、濕度及溫育條件。其次由同一實(shí)驗(yàn)員來進(jìn)行操作可人為誤差。

選擇素elisa試劑盒識(shí)別的配體都是一些寡糖基團(tuán)，迄今為止發(fā)現(xiàn)的配體都是一些具有唾液酸化路易斯寡糖(s-Le，siaglyl-Lewis)或類似結(jié)構(gòu)的分子。一種寡糖基團(tuán)可以存在多種糖蛋白和糖脂分子上，并分布于多種細(xì)胞表面，因此選擇素分子配體在體內(nèi)分布較為廣泛。

PCR方法已廣泛用于科研，在工業(yè)中也有不斷擴(kuò)大應(yīng)用的趨勢，它包括檢測一些病原體、檢測支原體污染、檢測細(xì)菌污染以及檢測殘留宿主DNA等。

PCR在工業(yè)中的應(yīng)用主要存在一個(gè)方法驗(yàn)證的問題，尤其是靈敏度的驗(yàn)證。靈敏度不夠，就會(huì)發(fā)生漏檢。另外，PCR所直接面對(duì)的樣本是DNA，而非病原菌或DNA，因此還需要做DNA抽提，這也是要注意的。

因此，如能采用PCR檢測支原體并替代藥典方法，還是能節(jié)省很多時(shí)間和精力。但PCR方法的驗(yàn)證需要較為完整。靈敏度驗(yàn)證是一個(gè)重要方面。靈敏度不夠，就會(huì)發(fā)生漏檢?！稓W洲藥典》第2.6.7章（EP 2.6.7）和《日本藥典》第十七版第G3章（JP G3），都規(guī)定，對(duì)于核酸擴(kuò)增法（如PCR）檢測支原體，如替代傳統(tǒng)的培養(yǎng)法，都要求檢測限達(dá)到10 CFU/ml。

具體驗(yàn)證可使用10CFU的支原體靈敏度標(biāo)準(zhǔn)品，它一般為凍干粉形式，需要用待測樣本的樣本基質(zhì)（需保證里面不含支原體）來復(fù)溶，再進(jìn)行DNA抽提以及PCR檢測。如檢測的電泳有條帶，或者qPCR檢測后的Ct值小于40，即表明檢測成功。

果實(shí)RNA提取-武漢友名生物由武漢友名生物技術(shù)有限公司提供。武漢友名生物技術(shù)有限公司是一家從事“商務(wù)服務(wù)”的公司。自成立以來，我們堅(jiān)持以“誠信為本，穩(wěn)健經(jīng)營”的方針，勇于參與市場的良性競爭，使“友名生物”品牌擁有良好口碑。我們堅(jiān)持“服務(wù)至上，用戶至上”的原則，使友名生物在其它中贏得了客戶的信任，樹立了良好的企業(yè)形象。 特別說明：本信息的圖片和資料僅供參考，歡迎聯(lián)系我們索取準(zhǔn)確的資料，謝謝！