酶切圖譜

圖譜介紹：DNA限制性內(nèi)切酶酶切圖譜，又稱(chēng)DNA的物理圖譜，它由一系列位置確定的多種限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)組成，以直線或環(huán)狀圖式表示。在DNA序列分析、基因組的功能圖譜繪制、DNA的無(wú)性繁殖、基因文庫(kù)的構(gòu)建等工作中，建立限制性內(nèi)切酶圖譜都是不可缺少的環(huán)節(jié)，內(nèi)切酶，近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的RFLP（限制性的片段長(zhǎng)度多態(tài)性）技術(shù)更是建立在它的基礎(chǔ)上。

構(gòu)建方法：構(gòu)建DNA限制性內(nèi)切酶圖譜有許多方法。通常結(jié)合使用多種限制性內(nèi)切酶，通過(guò)綜合分析多種酶單切及不同組合的多種酶同時(shí)切所得到的限制性的片段大小來(lái)確定各種酶的酶切位點(diǎn)及其相對(duì)位置。酶切圖譜的使用價(jià)值依賴于它的準(zhǔn)確性和準(zhǔn)確程度。

制作過(guò)程：在酶切圖譜制作過(guò)程中，為了獲得條帶清晰的電泳圖譜，一般DNA用量約為0.5-1μg。限制性內(nèi)切酶的酶解反應(yīng)zui適條件各不相同，各種酶有其相應(yīng)的酶切緩沖液和zui適反應(yīng)溫度（大多數(shù)為37℃）。對(duì)質(zhì)粒DNA酶切反應(yīng)而言，限制性內(nèi)切酶用量可按標(biāo)準(zhǔn)體系1μg DNA加1單位酶，消化1-2小時(shí)。但要完全酶解則必須增加酶的用量，一般增加2-3倍，甚至更多，反應(yīng)時(shí)間也要適當(dāng)延長(zhǎng)。

DNA部分片段的連接

　　DNA部分片段通過(guò)用每一種限制性內(nèi)切酶過(guò)量消化底物DNA而獲得。這些片段隨后用T4 DNA連接酶連接( 5′末端濃度為0.1-1.0 μM)。連接的片段然后用同一種限制性內(nèi)切酶重切。僅當(dāng)3′和 5′末端都保留完整，連接反應(yīng)才會(huì)發(fā)生;而且只有那些識(shí)別位點(diǎn)完全恢復(fù)的分子才能被重切。切割后正常的帶型說(shuō)明3′和 5′末端都是完整的，而且準(zhǔn)備的酶樣品中檢測(cè)不到核酸外切酶和磷酸酶。

根據(jù)限制酶的結(jié)構(gòu)，輔因子的需求切位與作用方式，可將限制酶分為三種類(lèi)型，分別是第yi型（Type I）、第二型（Type II）及第三型（Type III）。　　

第yi型限制酶同時(shí)具有修飾(modification)及認(rèn)知切割(restriction)的作用；另有認(rèn)知(recognize)DNA上特定堿基序列的能力，通常其切割位(cleavage site)距離認(rèn)知位(recognition)可達(dá)數(shù)千個(gè)堿基之遠(yuǎn)。例如：EcoB、EcoK。　　

第二型限制酶只具有認(rèn)知切割的作用，修飾作用由其他酵素進(jìn)行。所認(rèn)知的位置多為短的回文序列(palindrome sequence)；所剪切的堿基序列通常即為所認(rèn)知的序列。是遺傳工程上，實(shí)用性較高的限制酶種類(lèi)。例如：EcoRI、HindIII。　　

第三型限制酶與第yi型限制酶類(lèi)似，同時(shí)具有修飾及認(rèn)知切割的作用?？烧J(rèn)知短的不對(duì)稱(chēng)序列，切割位與認(rèn)知序列約距24-26個(gè)堿基對(duì)。例如：EcoPI、HinfIII。

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