轉(zhuǎn)基因Ca2+指示劑：轉(zhuǎn)基因技術(shù)和光遺傳技術(shù)的飛速發(fā)展，催生了基因編碼的Ca2+指示劑（GECIs）。它們不依賴于熒光染料，可以靶向特定的組織，如神經(jīng)細(xì)胞、心肌細(xì)胞、T細(xì)胞等，并且可以避免熒光指示劑帶來的的許多問題，是監(jiān)測轉(zhuǎn)基因動物體內(nèi)鈣離子的一個極好的工具。個基因編碼的鈣離子指示劑Cameleon早在1997年就發(fā)表了。它是利用與鈣離子結(jié)合后發(fā)生結(jié)構(gòu)變化，作為供體的CFP和作為受體的YFP之間產(chǎn)生FRET的原理。2000年，GCaMP誕生了。它是增強型綠色熒光蛋白（EGFP）和鈣調(diào)蛋白（結(jié)合鈣離子）、鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽M13組成的，結(jié)合鈣離子后，鈣調(diào)素-M13相互作用引起GFP空間結(jié)構(gòu)變化，發(fā)出綠色熒光（圖5）。GCaMP的問世有著**性的意義，它改變了我們觀察神經(jīng)元群體活動的方式，讓科學(xué)家們可以在成千上萬的細(xì)胞中，看到哪些神經(jīng)元在放電，它們放電的模式和規(guī)律是怎樣的，從而進一步探索各種內(nèi)在的神經(jīng)機制。鈣信號發(fā)揮著高度特異性的功能。上海常用鈣成像維修電話

隨著功能光學(xué)成像技術(shù)的發(fā)展，神經(jīng)學(xué)家們已經(jīng)可以研究腦區(qū)和神經(jīng)元內(nèi)部的工作情況。功能鈣成像技術(shù)就是其中之一，其主要原理是將外源性熒光信號和生理現(xiàn)象耦合起來——通過熒光染料信號的改變反映細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度，以此表示細(xì)胞的功能狀態(tài)。目前它被廣泛應(yīng)用于實時監(jiān)測一群相關(guān)神經(jīng)元內(nèi)鈣離子的變化，從而判斷其功能活動。該技術(shù)的出現(xiàn)使得科學(xué)家可以親眼目睹神經(jīng)信號在神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)之中時間和空間上的傳遞穿梭。功能光學(xué)成像技術(shù)的發(fā)展使研究腦區(qū)和神經(jīng)元的內(nèi)部工作成為可能。上海常見鈣成像產(chǎn)品介紹神經(jīng)方面科學(xué)迫切需要一種能夠兼顧全局和微觀的新型鈣成像技術(shù)。

包含鈣離子指示劑的細(xì)胞可以通過熒光顯微鏡(fluorescencemicroscope)觀測，然后通過CCD攝像機捕捉、記錄圖像?，F(xiàn)在鈣成像技術(shù)主要在以下幾類神經(jīng)科學(xué)研究方面有廣泛應(yīng)用：1.記錄培養(yǎng)的神經(jīng)元的活動。2.記錄腦片上神經(jīng)元的活動。3.huoti記錄神經(jīng)元的活動。由于離體實驗本身的限制，現(xiàn)在越來越多的神經(jīng)方面科學(xué)家傾向于做在體鈣成像實驗，希望能得到更準(zhǔn)確且更能反應(yīng)生理狀況的數(shù)據(jù)。得益于雙光子熒光顯微鏡的發(fā)展，現(xiàn)在在實驗動物處于huoti狀態(tài)下的鈣成像技術(shù)取得了飛速進展。4.記錄神經(jīng)元樹突和樹突棘（spine）的活動。由于對于實驗精度的要求，有些科學(xué)家不僅只想記錄單個神經(jīng)元的反應(yīng)，他們還想更確切地知道神經(jīng)元上哪些樹突和樹突棘參與了某個行為，也就是說他們需要在huoti條件下，對單根樹突以及某些spine進行鈣成像記錄實驗。由于雙光子熒光顯微鏡和GCaMP6基因編碼鈣離子指示劑的發(fā)展，現(xiàn)在，對樹突和樹突棘用鈣成像實驗進行記錄也成為了可能。

指示劑是如何負(fù)載細(xì)胞，目前有三種在神經(jīng)元上填充鈣離子指示劑的方法，且都可以用于體內(nèi)和體外研究。第一種方法是利用玻璃吸管將膜滲透性鹽或葡聚糖形式的指示劑注入單個神經(jīng)元中。此方法方便實驗者控制單個神經(jīng)元內(nèi)的鈣離子指示劑濃度且信噪比較高。第二種是利用“批量加載”的方法將鈣離子指示劑染料負(fù)載神經(jīng)元，觀察對象為一群神經(jīng)元。盡管此方法可能導(dǎo)致一些膠質(zhì)細(xì)胞也被指示劑所標(biāo)記，但明顯提高了整體神經(jīng)元的標(biāo)記百分比，使研究者得以觀察到一群神經(jīng)元內(nèi)動作電位相關(guān)性的活動。第三種也較為常用，通過病毒轉(zhuǎn)染的方式使其基因編碼鈣離子指示劑。雙光子熒光顯微鏡的發(fā)展，使在實驗動物處于活動狀態(tài)下的鈣成像技術(shù)取得了飛速進展。

對于雙光子（2P）鈣成像而言，離焦和近表面熒光激發(fā)是兩個大的深度限制因素，而對于三光子成像這兩個問題大大減小，但是三光子成像由于熒光團的吸收截面比2P要小得多，所以需要更高數(shù)量級的脈沖能量才能獲得與2P激發(fā)的相同強度的熒光信號。功能性三光子顯微鏡比結(jié)構(gòu)性三光子顯微鏡的要求更高，它需要更快速的掃描，以便及時采樣神經(jīng)元活動；需要更高的脈沖能量，以便在每個像素停留時間內(nèi)收集足夠的信號。復(fù)雜的行為通常涉及到大型的大腦神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)既具有局部的連接又具有遠(yuǎn)程的連接。要想將神經(jīng)元活動與行為聯(lián)系起來，需要同時監(jiān)控非常龐大且分布guangfan的神經(jīng)元的活動，大腦中的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)會在幾十毫秒內(nèi)處理傳入的刺激，要想了解這種快速的神經(jīng)元動力學(xué)，就需要MPM具備對神經(jīng)元進行快速成像的能力。快速MPM方法可分為單束掃描技術(shù)和多束掃描技術(shù)神經(jīng)元鈣成像的原理是利用特殊的熒光染料或鈣離子指示劑將神經(jīng)元中鈣離子濃度的變化通過熒光強度表現(xiàn)出來。上海鈣成像nVoke

鈣成像系統(tǒng)具有單細(xì)胞分辨率的大視野的特征。上海常用鈣成像維修電話

可見光激發(fā)Ca2+熒光探針：與紫外光激發(fā)探針相比，可見光激發(fā)Ca2+探針具有更強的染料吸收性能，對Ca2+變化水平檢測敏感度也更高，能夠降低對活細(xì)胞的光毒性和樣品自發(fā)熒光以及光散射的干擾，且無光譜偏移。較常使用的可見光激發(fā)Ca2+熒光探針有Fluo-3，F(xiàn)luo-4，Rhod-2等，同時他們也都是非比率型指示劑。Fluo-3是較常用的可見光激發(fā)Ca2+熒光指示劑之一，是典型的的單波長指示劑，比較大激發(fā)波長為506nm，比較大發(fā)射波長為526nm。它與Ca2+結(jié)合之前幾乎無熒光，結(jié)合后熒光會增加60至100倍，從而避免了細(xì)胞自身的熒光干擾。實際檢測時推薦使用的激發(fā)波長為488nm左右，發(fā)射波長為525～530nm（圖3）。Fluo-3可以用在激光共聚焦顯微成像或流式細(xì)胞儀中。它還有一個升級版本Fluo-4，在相同Ca2+濃度下信號更強。上海常用鈣成像維修電話