全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序    

全轉(zhuǎn)錄組是指特定組織或細(xì)胞在特定狀態(tài)下所有轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的總和，包括mRNA和各種noncoding RNA?；瘜W(xué)鍵合固定相，根據(jù)鍵合的基團(tuán)不同可用于反相或正相色譜，其中常用的是十八烷基硅l烷(又稱ODS)鍵合硅膠，可用于反相色譜或離子對(duì)色譜離子交換填料，用于離子交換色譜，是有一定孔徑的大孔填料，用于排阻色譜。我們知道生物體本身的轉(zhuǎn)錄過(guò)程是一個(gè)動(dòng)態(tài)變化且十分復(fù)雜的分子作用網(wǎng)絡(luò)，如果只是對(duì)某個(gè)單一RNA分子的研究，有時(shí)并不能準(zhǔn)確的發(fā)現(xiàn)分子作用機(jī)制。而競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA(ceRNA)理論闡述了一種全新的轉(zhuǎn)錄調(diào)控模式：ceRNA（包括lncRNA、circRNA、mRNA、假基因等）分子能夠通過(guò)miRNA應(yīng)答元件（microRNA Respe Element, MRE）競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合相同的miRNA來(lái)調(diào)節(jié)彼此的表達(dá)水平。舉個(gè)例子：miRNA會(huì)導(dǎo)致基因沉默現(xiàn)象發(fā)生，而如果lncRNA競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合了miRNA，從而影響了miRNA基因沉默功能實(shí)現(xiàn)。

      ceRNA是目前轉(zhuǎn)錄調(diào)控領(lǐng)域的熱點(diǎn)內(nèi)容之一，通過(guò)全轉(zhuǎn)錄組研究能夠系統(tǒng)性的闡述ceRNA的分子作用機(jī)制。此外，Illumina還捕獲了未翻譯的區(qū)域，這是NimbleGen和安捷倫平臺(tái)無(wú)法靶定的。目前對(duì)全轉(zhuǎn)錄組簡(jiǎn)便的方法就是構(gòu)建2個(gè)測(cè)序文庫(kù)分別進(jìn)行測(cè)序。標(biāo)準(zhǔn)的生物信息學(xué)分析能夠得到mRNA、lncRNA、circRNA、miRNA各自的研究?jī)?nèi)容，靶向調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、ceRNA網(wǎng)絡(luò)、共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析可以將這幾種RNA聯(lián)合起來(lái)分析，從而發(fā)現(xiàn)新的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)模型。去除rRNA的鏈特異性文庫(kù)，含有的RNA信息含量十分豐富，通過(guò)測(cè)序和生物信息學(xué)分析能夠得到mRNA、lncRNA、circRNA的鑒定及注釋信息。不過(guò)該文庫(kù)構(gòu)建時(shí)會(huì)進(jìn)行片段化選擇從而濾掉了small RNA的信息，所以需要另外再構(gòu)建一個(gè)small RNA文庫(kù)，進(jìn)行測(cè)序分析后可以得到miRNA和其他small RNA的鑒定及注釋信息。全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序方案路線圖如下所示：

2.引物純化方式有哪些，如何選擇？

◆　脫鹽

寡核苷酸合成后，為了純化寡核苷酸成為天然的DNA結(jié)構(gòu)，首先必須去除保護(hù)基團(tuán)。同一細(xì)胞在不同的生長(zhǎng)時(shí)期及生長(zhǎng)環(huán)境下，其基因表達(dá)情況是不相同的。通過(guò)濃氨水處理，合成的寡核苷酸從固相載體上分離，2-乙氧基--磷酸二脂鍵的保護(hù)基團(tuán)，以及堿基的保護(hù)基團(tuán)基（苯甲?；彤惗』┍蝗コ?，從而形成了天然的DNA結(jié)構(gòu)。然而，必要的去保護(hù)步驟完成后，寡核苷酸混合物還包含幾種必須被去除的小分子有機(jī)化合物。所有非必須有機(jī)化合物被移除的過(guò)程通常叫做脫鹽。脫鹽純化可以借助反向硅膠柱進(jìn)行。盡管脫鹽純化可以移除所有的非必須有機(jī)雜質(zhì)，但它不能有效移除合成中產(chǎn)生微量的提前終止的寡核苷酸雜鏈。然而，脫鹽的寡核苷酸還是能夠滿足ＰＣＲ檢測(cè)等基礎(chǔ)生物研究。

◆　BioRP / OPC純化

如果寡核苷酸以“三苯”的形式合成，則N-寡核苷酸包含5’-DMT基團(tuán)，提前終止的寡核苷酸不包含該基團(tuán)。因?yàn)镈MT基有強(qiáng)的親脂的特性，有5’-DMT基團(tuán)的寡核苷酸與反相樹(shù)脂有親和性，因此反相親和樹(shù)脂通常被用于寡核苷酸的純化。利用反向樹(shù)脂和5’－DMT寡核苷酸存在強(qiáng)親和力，但是提前終止的寡核苷酸不包含DMT基團(tuán)，所以，我們能夠成功的把想要的N-寡核苷酸從提前終止的寡核苷酸雜質(zhì)中分離出來(lái)?；蚪M甲l基化水平(MethylationContent)的分析:1。

9.如何計(jì)算引物的Tm值？

答：引物設(shè)計(jì)軟件都可以給出Tm，與引物長(zhǎng)度、堿基組成、引物使用緩沖的離子強(qiáng)度有關(guān)。

長(zhǎng)度為25mer以下的引物，Tm計(jì)算公式為：

Tm =            4℃   (G C) 2℃   (A T)

對(duì)于更長(zhǎng)的寡聚核苷酸，Tm計(jì)算公式為：

Tm = 81.5 16.6 x Log10[Na ] 0.41 (%GC) - 600/size

公式中，Size = 引物長(zhǎng)度。

Tm的定義：Tm = Temperature at which 50% of a given oligonucleotide is hybridized to its complementary strand. In the absence of destabilizing agents, like formamide or urea, Tm will depend on 3 major parameters: The sequence: a GC-rich sequence has a higher melting temperature. The strand concentration: high oligonucleotide concentrati favor hybrid formation, which results in a higher melting temperature. The salt concentration: high ionic strength results in a higher Tm as cati stabilize the DNA duplexes.

15.測(cè)序發(fā)現(xiàn)引物有突變是怎么回事？

答：測(cè)序發(fā)現(xiàn)引物區(qū)域有突變，特別是40個(gè)堿基以下的引物, 發(fā)生的概率不大，但是肯定也會(huì)發(fā)生。用戶一般可以放心，引物序列一般都是通過(guò)電腦直接將您的序列COPY到合成儀的，堿基輸錯(cuò)的機(jī)會(huì)不多。核酸合成公司一般會(huì)有一套控制辦法，預(yù)防堿基輸入錯(cuò)誤。發(fā)生這種突變的原因有很多解釋，人們還沒(méi)有辦法解決這個(gè)問(wèn)題。在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以病毒RNA為模板合成cDNA再通過(guò)DNA、轉(zhuǎn)錄、翻譯等過(guò)程形成病毒顆粒。引物合成的固相合成原理都一樣，采用的機(jī)器也基本相同，合成主要原料都是由可數(shù)的幾家跨國(guó)公司提供的，所有每個(gè)合成服務(wù)商遇到的問(wèn)題也基本類似，沒(méi)有人可以超脫。

引物合成是一種多步驟的化學(xué)反應(yīng)，合成也就是99%，副產(chǎn)品不可以避免。引物序列中插入突變往往是堿基重復(fù)，一般認(rèn)為，偶連過(guò)程中，正在偶連的部分單體發(fā)生丟失DMT,導(dǎo)致單體又接了上去，故發(fā)生插入同一堿基的突變。至于缺失突變，一般認(rèn)為是一般認(rèn)為是帶帽(capping)反應(yīng)不造成的，Caping反應(yīng)主要是封閉數(shù)5′-羥基沒(méi)有參加反應(yīng)單體。被封閉的引物，在下一輪偶連時(shí)將不能繼續(xù)參與合成。對(duì)于堿基置換的突變，產(chǎn)生的原因一般認(rèn)為是堿基不能100%脫保護(hù)，即引物上可能含有殘留保護(hù)基團(tuán)，引物的這些區(qū)域不能很好地與互補(bǔ)鏈配對(duì)，當(dāng)擴(kuò)增的產(chǎn)品被亞轉(zhuǎn)化到大腸中，可能被細(xì)菌中修復(fù)系統(tǒng)補(bǔ)上了非配對(duì)的堿基。置換突變通常發(fā)生在G 轉(zhuǎn)換成其它堿基。堿基G在一定條件下可以轉(zhuǎn)化為烯醇異構(gòu)體 （脫呤），2,6 diaminopurine , DNA和擴(kuò)增過(guò)程中DNA聚合酶將2,6 diaminopurine看作堿基A，測(cè)序就會(huì)發(fā)現(xiàn)堿基G-A置換。脫呤現(xiàn)象在富含呤的引物中發(fā)生的頻率較高。lncRNA-Seq可一次性獲得樣本中全部的lncRNAs信息，對(duì)lncRNAs的類別、功能進(jìn)行的深入分析，從而快速準(zhǔn)確地獲得與特定生物學(xué)過(guò)程（例如發(fā)育、疾病等）相關(guān)lncRNA信息。脫呤的引物在引物后處理脫保護(hù)階段如果被降解，測(cè)序就會(huì)發(fā)現(xiàn)堿基G或A的缺失。

引物合成過(guò)程中，造成堿基插入，缺失，置換突變的因素客觀存在，有不少降低發(fā)生的頻率建議和措施，但是這些措施還停留在實(shí)驗(yàn)室階段，還沒(méi)有能夠應(yīng)用到規(guī)?；a(chǎn)中。