基因的分子手術(shù)是相當(dāng)復(fù)雜的過程，其中zui重要的是連接酶

互補堿基之間的配對，形成雙鏈。并在DNA連接酶的作用下，使同一DNA分子的兩端連接成環(huán)狀，或使兩個分子連成一大的線狀分子。不同限制性內(nèi)切酶切割DNA產(chǎn)生的三種不同類型的末端。

基因的分子手術(shù)是相當(dāng)復(fù)雜的過程，除了需要限制性內(nèi)切酶外，還需要其他- -些工具酶包括連接酶、DNA 聚合酶、RNA聚合酶、核酸酶、末端修飾酶等，對DNA或RNA進(jìn)行各種各樣的修飾。其中zui重要的是連接酶。

DNA連接酶的性質(zhì)

噬菌體T4DNA連接酶分子也是一條多肽鏈，分子量為60Ku，其活性很容易被0.2mol/L的KCl和精胺所抑制。此酶的催化過程需要ATP輔助。T4DNA連接酶可連接DNA-DNA，DNA-RNA，RNA-RNA和雙鏈DNA粘性末端或平頭末端。另外，NH4C1可以提高在大腸桿1菌DNA連接酶的的催化速率，而對T4DNA連接酶則無效。無論是T4DNA連接酶，還是大腸桿1菌DNA連接酶都不能催化兩條游離的DNA鏈相連接。

DNA copy主要的特點是半保留copy、半不連續(xù)copy。在copy過程中，原來雙螺旋的兩條鏈并沒有被破壞，它們分成單獨的鏈，每一條舊鏈作為模板再合成一條新鏈，這樣在新合成的兩個DNA分子中，一條鏈?zhǔn)桥f的而另外一條鏈?zhǔn)切碌?，因此這種copy方式被稱為半保留copy。

DNA的兩條鏈?zhǔn)欠聪蚱叫械模粭l是 5'→3'方向，另一條是 3'→5'方向。在copy起點處，兩條鏈解開形成copy泡(replication bubble ), DNA向兩側(cè)copy形成兩個copy叉(replication fork)。隨著DNA的不斷解旋，兩條鏈變成單鏈形式，可以作為模板合成新的互補鏈。但是，生物細(xì)胞內(nèi)所有的DNA聚合酶都只 能催化 5'→3'延伸。因此，以3 '→5'的鏈為模板鏈時，DNA聚合酶可以沿 5'→3'的方向合成互補的新鏈，這條鏈稱為前導(dǎo)鏈(leading strand )。當(dāng)以另一條鏈為模板時則不能連續(xù)合成新鏈，這條鏈稱為滯后鏈(lagging strand )。這時，DNA聚合酶從copy叉的位置開始向遠(yuǎn)離copy叉的方向合成1?2 kb的新鏈片段，待copy叉向前移動相應(yīng)的距離后，又重復(fù)這一過程，合成另一個類似大小的新鏈片段，這些片段被稱為岡崎片段(Okazaki fragment)。zui后，由另一種DNA聚合酶和DNA連接酶負(fù)責(zé)把這些岡崎片段之間的RNA引物除去，并把缺口補平，使岡崎片段連成完整的DNA鏈。這種前導(dǎo)鏈的連續(xù)copy和滯后鏈的不連續(xù)copy在生物細(xì)胞中是普遍存在的，稱為DNA的半不連續(xù)copy。

所有合成cDNA條鏈的方法都要用依賴于RNA的DNA聚合酶(反轉(zhuǎn)錄酶)來催化反應(yīng)，主要有兩個關(guān)鍵因素，一個是mRNA模板，另一個是反轉(zhuǎn)錄酶 [3]  。商品化反轉(zhuǎn)錄酶有從禽類成髓細(xì)胞瘤病毒純化到的禽類成髓細(xì)胞病毒（AMV）逆轉(zhuǎn)錄酶和從表達(dá)化的Moloney鼠病毒反轉(zhuǎn)錄酶基因的大腸中分離到的鼠病毒（MLV）反轉(zhuǎn)錄酶。AMV反轉(zhuǎn)錄酶包括2個具有若干種酶活性的多肽亞基，這些活性包括依賴于RNA的DNA合成，依賴于DNA的DNA合成以及對DNA-RNA雜交體的RNA部分進(jìn)行內(nèi)切降解（RNA酶H活性）。MLV反轉(zhuǎn)錄酶只有單個多肽亞基，兼?zhèn)湟蕾囉赗NA和依賴于DNA的DNA合成活性，但降解DNA—RNA雜交體中的RNA的能力較弱。且其熱穩(wěn)定性較AMV反轉(zhuǎn)錄酶差。MLV反轉(zhuǎn)錄酶能合成較長的eDNA（如大于2～3kb）。AMV反轉(zhuǎn)錄酶和MI。V反轉(zhuǎn)錄酶利用RNA模板合成cDNA時的適pH、適鹽濃度和適溫度各不相同．所以合成鏈時相應(yīng)調(diào)整條件是非常重要的。