11.如何溶解引物？

答：干燥后的引物質(zhì)地非常疏松，開蓋前好離心一下，或管垂直向上在桌面上敲敲，將引物粉末收集到管底。根據(jù)計算出的體積加入去離子無菌水或10mM Tris pH7.5緩沖液，室溫放置幾分鐘，振蕩助溶，離心將溶液收集到管底。溶解引物用的水一般不要用蒸餾水，因為有些蒸餾水的pH值比較低（pH4-5）,引物在這種條件下不穩(wěn)定。傳統(tǒng)的基于2D雙向凝膠電泳分離的蛋白質(zhì)組通常可以鑒定出約1000種蛋白，對全蛋白質(zhì)組的覆蓋僅在5~10%左右，不能滿足高通量定量蛋白質(zhì)表達譜分析的要求。

12.如何保存引物？

答：引物合成后，經(jīng)過一系列處理和純化步驟，旋轉(zhuǎn)干燥而成片狀物質(zhì)。引物在溶解前，室溫狀態(tài)下可以長期保存。溶解后的引物-20度可以長期保存。如果對實驗的重復性要求較高，合成的OD數(shù)較大，建議分裝，避免反復凍融。修飾熒光引物需要避光保存。

15.測序發(fā)現(xiàn)引物有突變是怎么回事？

答：測序發(fā)現(xiàn)引物區(qū)域有突變，特別是40個堿基以下的引物, 發(fā)生的概率不大，但是肯定也會發(fā)生。用戶一般可以放心，引物序列一般都是通過電腦直接將您的序列COPY到合成儀的，堿基輸錯的機會不多。核酸合成公司一般會有一套控制辦法，預防堿基輸入錯誤。發(fā)生這種突變的原因有很多解釋，人們還沒有辦法解決這個問題。引物合成的固相合成原理都一樣，采用的機器也基本相同，合成主要原料都是由可數(shù)的幾家跨國公司提供的，所有每個合成服務商遇到的問題也基本類似，沒有人可以超脫。EMSA實驗EMSA:凝膠遷移或電泳遷移率檢測是一種檢測蛋白質(zhì)和DNA序列相結(jié)合的技術(shù)，初用于研究DNA結(jié)合蛋白和其相關(guān)的DNA結(jié)合序列相互作用，可用于定性和定量分析。

引物合成是一種多步驟的化學反應，合成也就是99%，副產(chǎn)品不可以避免。引物序列中插入突變往往是堿基重復，一般認為，偶連過程中，正在偶連的部分單體發(fā)生丟失DMT,導致單體又接了上去，故發(fā)生插入同一堿基的突變。至于缺失突變，一般認為是一般認為是帶帽(capping)反應不造成的，Caping反應主要是封閉數(shù)5′-羥基沒有參加反應單體。被封閉的引物，在下一輪偶連時將不能繼續(xù)參與合成。對于堿基置換的突變，產(chǎn)生的原因一般認為是堿基不能100%脫保護，即引物上可能含有殘留保護基團，引物的這些區(qū)域不能很好地與互補鏈配對，當擴增的產(chǎn)品被亞轉(zhuǎn)化到大腸中，可能被細菌中修復系統(tǒng)補上了非配對的堿基。置換突變通常發(fā)生在G 轉(zhuǎn)換成其它堿基。堿基G在一定條件下可以轉(zhuǎn)化為烯醇異構(gòu)體 （脫呤），2,6 diaminopurine , DNA和擴增過程中DNA聚合酶將2,6 diaminopurine看作堿基A，測序就會發(fā)現(xiàn)堿基G-A置換。脫呤現(xiàn)象在富含呤的引物中發(fā)生的頻率較高。脫呤的引物在引物后處理脫保護階段如果被降解，測序就會發(fā)現(xiàn)堿基G或A的缺失。SNP是我們考察遺傳變異的單位,據(jù)估計,人類的所有群體中大約存在一千萬個SNP位點。

引物合成過程中，造成堿基插入，缺失，置換突變的因素客觀存在，有不少降低發(fā)生的頻率建議和措施，但是這些措施還停留在實驗室階段，還沒有能夠應用到規(guī)?；a(chǎn)中。

16.長鏈引物為什么出錯的幾率非常高？

答：引物合成時，每一步反應效率都不能達到100%，產(chǎn)生堿基插入、缺失、置換突變的因素客觀條件都有一直存在。引物鏈越長，突變的頻率累加起來就越高。研究人員總希望合成的引物萬無一失，這種心情可以理解。但是猶如PCR擴增，不可能保證擴增產(chǎn)物中沒有突變，引物合成也不可能保證100%正確。要知道，引物合成中發(fā)生錯誤（非人為因素）的頻率，比任何高保真高溫聚合酶PCR擴增過程所產(chǎn)生的頻率都要高。做引物合成，長鏈引物合成，您要有引物中部分引物可能有突變的思想準備。用新一代高通量測序技術(shù)對某物種的特定組織或細胞進行轉(zhuǎn)錄組測序，與參考基因組比較，可以得到基因表達差異、可變剪接、融合基因等遺傳調(diào)控信息。

17.如果測序發(fā)現(xiàn)突變，該如何處理？

答：遇到這種情況，首先和核酸合成廠家取得聯(lián)系，生產(chǎn)人員會檢查生產(chǎn)的原始記錄，主要是核對合成序列是否和定單一致，他們在電腦中一般會保留所有原始數(shù)據(jù)。在確認引物合成序列沒有輸錯的情況下，建議重新挑取測序，可能會找到正確的。根據(jù)經(jīng)驗，40個堿基以下的引物，測1-2個就可以了；一方面，多數(shù)蛋白質(zhì)的溶解度隨著溫度的升高而增大，因此，溫度高利于溶解，縮短提取時間。40個以上的特別是用于全片段拼接合成的，就需要多測一些了。一般情況下，每個突變的位點都不一樣，提示正確的總是有的，就是如何找到它。也可以要求公司將引物免費重合一次，不過重合的引物和次的引物一樣，都可能含突變，不會因為重合的引物就減少您的遇到問題的幾率?；蚱唇舆^程中，如果發(fā)現(xiàn)一段區(qū)域突變點不多，就多測幾個，否則就重合一下引物。