如何用制備色譜柱制備低含量的雜質(zhì)？

制備色譜柱為ZorbaxSB-C18 9.4*250mm及gilson餾分收集器，色譜儀為Agilent1100或LC-6A。想用其制備面積歸一化法含量為0.05%左右的雜質(zhì)，初步提純后用高分辨的LC-MS進(jìn)行定性分析。如何設(shè)定色譜條件，如，流量、進(jìn)樣量、樣品的濃度、切割點(diǎn)的設(shè)置、是否要濃縮，要求將95%以上的主峰切除。

（主峰后有二個(gè)雜質(zhì)靠得很近。）

答：

1.制備用的流動(dòng)相盡量等級(jí)高一點(diǎn)，否則流動(dòng)相中的雜質(zhì)會(huì)影響LC-MS分析。

2.使用餾分收集器時(shí)，延遲體積一定要計(jì)算準(zhǔn)確，檢測(cè)器的響應(yīng)時(shí)間設(shè)到很小，否則都會(huì)影響收集的純度和回收率。制備柱的流速一般與直徑的平方成正比，如果4.6mm分析柱流速為1mL/min，9.4mm制備柱用1*（9.4/4.6）2,大約為4mL/min。進(jìn)樣量設(shè)到幾個(gè)mg應(yīng)該基本沒有過載。進(jìn)樣樣品濃度越高越好。假如進(jìn)樣10mg，理論計(jì)算0.05%的雜質(zhì)大約只有5μg，顯然濃度太低，盡量是多做幾次，合并餾分然后濃縮后做LC-MS分析。

多肽的分離制備,如何上量？如何增大分離度?

反相HPLC應(yīng)當(dāng)是很好的分離小肽方法，用CH3CN或CH3OH：H2O（95：5）做流動(dòng)相，看保留如何，若無保留，建議改用其他色譜方法進(jìn)行分離。

關(guān)于多肽的分離，首先要知道它的分子量大小，然后選擇不同類型的填料，如孔徑的大小。我們先在分析柱（4.6mm內(nèi)徑）上做一下實(shí)驗(yàn),找到很大的分離度,這一過程的難度是很大的,要不斷地改變流動(dòng)相和固定相,然后再線性或非線性放大到制備,放大的倍數(shù)按分析柱的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。分離后可以通過冷凍干燥得到固體。

還可以考慮離子交換來分l離。

同一種填料的分析柱、制備柱按線形放大公式套，分離度會(huì)不會(huì)變化？

一般會(huì)有一定的變化，原因有以下幾點(diǎn)：

（1）制備柱的裝填是否均勻，如不均勻則可能產(chǎn)生渦流擴(kuò)散使各個(gè)組分的經(jīng)過通道的直徑不同、阻力不一樣，停留時(shí)間不同，色譜峰可能變寬。

（2）如果樣品在流動(dòng)相中溶解度小，在制備色譜上會(huì)有不同的峰展寬。

（3）如果樣品在分析柱上有展寬或拖尾的現(xiàn)象，放大到制備柱上后峰的展寬和拖尾經(jīng)常會(huì)非常嚴(yán)重，導(dǎo)致分離失敗。

制備色譜

制備色譜是以分離出純物質(zhì)為目的的色譜系統(tǒng)，分析色譜是以分析出樣品組分信息為目的的色譜系統(tǒng)，基于他們目的的不同，制備色譜相對(duì)于分析色譜有很多不同特征，不能簡單等同。

當(dāng)我們?cè)趯?shí)驗(yàn)室中想得到納克乃至毫克級(jí)的純物質(zhì)時(shí)，稍微改裝下分析型色譜系統(tǒng)就能簡單輕松的完成，不過，若所需制備的純品量很大，此時(shí)，再用分析型色譜系統(tǒng)分離純化，可以預(yù)見這將是一場(chǎng)“災(zāi)難”。

制備色譜常用的色譜模式有低壓，中壓，高壓三種，以應(yīng)對(duì)不同類型和不同純度要求的樣品的分離，同時(shí)盡可能減少成本。